Valutazione del ruolo funzionale di SlERF-B3 e SlERF-F4 tramite analisi molecolari dei mutanti CRISPR/Cas9.

Evaluation of the functional role of SlERF-B3 and SlERF-F4 through molecular analyses of CRISPR/Cas9 mutants. Solanum lycopersicum L. is one of the most cultivated species, its productivity is strongly limited by abiotic stress, particularly water and saline. Salt is concentrated with irrigation with consequent loss of cultivable land. Plants react by cascade signals regulated by transcription factors (TF). In this thesis two TFs were studied, SlERF-B3 and SlERF-F4 belonging to the AP2/ERF family. CRISPR/Cas9 transfoated lines for the KO for the two genes in Solanum lycopersicum were obtained at the Agricultural Genetics laboratory. The design of the constructs involved the use of two gRNAs to obtain a gene deletion between the two gRNAs The objectives of the thesis were: i) the molecular screening of the CRISPR/Cas transformants, ii) the evaluation of the salt stress response of the mutant lines. We looked for the plants of the T0 generation of the knock-out line for the SlERF-B3 and SlERF-F4 generation to check if Cas9 was integrated. The target locus was amplified to verify the desired deletion. SlERF-B3 did not present a deletion, so the action of Cas9 on the first gRNA was analyzed, sequenced and analyzed with the online tool TIDE. Subsequently, the T1 generation was obtained within a homozygous individual was selected on which the physiological analysis was conducted. The integration of the transgene (Cas9) has been verified on the mutant KO lines for SlERF-F4. The target locus was subsequently amplified to verify which deletion occurred. Several multi-band situations have been identified to support a possible deletion. The cloning of the most interesting bands allowed Sanger sequencing. The sequences obtained were assembled, the alignment highlighted deletions, a bi-allelic sample was identified with two different deletions. Starting from the KO plant both for SlERF-F4 and for SlERF-B3 individuals of the T1 and T2 generation have been obtained. On the plants of the T1 generation a salt stress was applied in hydroponic conditions supplementing 150 ppm of NaCl. In wild type plants under stress conditions there was a 79.80% decrease in stomatal conductance. The plants in stress of the SlERF-F4 KO line suffered a decrease in stomatal conductance of 13.76% indicating the activation of a mechanism that allows a better tolerance to the presence of salt, a decrease of 64% was recorded in the line SlERF-B3 KO which behaves similarly to the wild type plant. The T2 generation has been tested in jiffy. From the phenotypic point of view, plants of the SlERF-B3 KO line showed a marked morphological variation compared to the WT line. The SlERF-F4 line, on the other hand, did not show significant differences, but delayed maturation and a less intense red color. The response of the SlERF-F4 line appears to be promising, but future analyzes will be required on further stresses as well as identification of the mechanisms involved.

Titolo: Valutazione del ruolo funzionale di SlERF-B3 e SlERF-F4 tramite analisi molecolari dei mutanti CRISPR/Cas9 Abstract Solanum lycopersicum L. è delle specie più coltivate e commercializzate, la sua produttività è fortemente limitata stress abiotici in particolare idrico e salino. Il sale si concentra con irrigazioni e con conseguente perdita di terreni coltivabili. Le piante reagiscono mediante cascate di segnali regolati da Fattori di trascrizione (TF). In questa tesi si sono studiati due TF, SlERF-B3 e SlERF-F4 appartenenti alla famiglia AP2/ERF. Presso il laboratorio di Genetica Agraria sono state ottenute delle linee trasformanti CRISPR/Cas9 per il KO per i due geni in Solanum lycopersicum. La progettazione dei costrutti ha previsto l'utilizzo di due gRNA per ottenere una delezione genica fra i due gRNA. Gli obiettivi della tesi sono stati: i) lo screening molecolare dei trasformanti CRISPR/Cas, ii) la valutazione della risposta allo stress salino delle linee mutanti. Si sono ricercate quali piante della generazione T0 della linea knock-out per SlERF-B3 e SlERF-F4 presentassero la integrata Cas9. Per verificare l'eventuale delezione desiderata sono stati amplificati i locus target. SlERF-B3 non ha presentato una delezione, allora si è analizzata l'azione della Cas9 sul primo gRNA trami sequenziati ed analizzati con lo strumento online TIDE. Successivamente, si è ottenuta la generazione T1 all'interno della quale è stato selezionato, un individuo omozigote sul quale impostare le analisi di tipo fisiologico. Sulle linee mutanti KO per SlERF-F4 è stata verificata l'integrazione del transgene (Cas9). Successivamente è stato amplificato il locus target per verificare l'avvenuta delezione. Sono state individuate alcune situazioni multibanda a supporto di un'eventuale delezione. Il clonaggio delle bande più interessanti ha permesso il sequenziamento Sanger. Le sequenze ottenute sono state assemblate e l'allineamento ha evidenziato delezioni, è stato individuato un campione bi-allelico avente due diverse delezioni. A partire dalla pianta KO sia per SlERF.F4 che per SlERF.B3 sono state ottenuti individui della generazione T2 e T2. Sulle piante della generazione T1 è stato applicato uno stress salino in condizioni di idroponica supplementando 150 ppm di NaCl. Nelle piante wild type in condizioni di stress si è rilevata una diminuzione del 79,80% della conduttanza stomatica. Le piante in stress della linea SlERF-F4 KO hanno subito una diminuzione della conduttanza stomatica del 13,76% indicando l'attivazione di un meccanismo che permette una migliore tolleranza alla presenza di sale, una diminuzione del 64%‬ è stata registrata nella linea SlERF-B3 KO che si comporta in modo analogo alla pianta wild type. La generazione T2 è stata testata in jiffy. Dal punto di vista fenotipico piante della linea SlERF-B3 KO hanno mostrato un'accentuata variazione morfologica rispetto alla linea WT. La linea SlERF-F4 invece non ha presentato differenze significative, maritardo nella maturazione ed una colorazione rossa meno intensa. La risposta della linea SlERF.F4 sembra essere promettente, ma saranno necessarie analisi future condotte su ulteriori stress nonché un'individuazione dei meccanismi coinvolti.