Applicazioni della tecnica di androgenesi in Anemone coronaria L. e Ranunculus asiaticus L.

In plants, by applying the in vitro culture of anthers it is possible to produce haploid plants, through a process defined androgenesis or gametic embryogenesis. Haploid plants possess a gametic chromosome number (2n=x) and, after spontaneous or artificial diploidization, originate fully homozygous plants defined di- or double-haploids (DH). DHs are of great interest for plant breeders since when intercrossed originate uniform and often heterotic F1 hybrids. In this thesis the in vitro anther culture technique was applied in two outcrossing and highly heterozygous ornamental species: Anemone coronaria L. and Ranunculus asiaticus L., whose chromosome number is 2n=2x=16. In particular, the flower bud developmental stage at which collect anthers, a protocol for anther sterilization as well as a suitable culture medium for inducing pollen embryogenesis have been identified. Haploid plants have been detected through flow-cytometric analyses, chromosome counts in meristematic cells of root apexes as well as by assessing the number of stomata and dimension of stomatal guard cells. Considering the high frequency of diploid regenerated plants in both species, with the goal to identify plants resulting from spontaneous diploidization of a haploid embryo in respect to the ones originated from somatic embryogenesis of anther wall cells, SSR (Simple Sequence repeats) markers has been developed. Due to huge dimension of the genomes of both species, e.g. 9 and 6 Gbp (1C) in anemone and ranunculus respectively, microsatellites identification was performed through transcriptome sequencing and diagnostic SSR markers developed.

Mediante coltura in vitro di antere è possibile indurre il processo di androgenesi o embriogenesi gametica allo scopo di ottenere piante aploidi (2n=x), il cui numero di cromosomi corrisponde a quello presente nei gameti della pianta. Piante aploidi, spontaneamente o artificialmente diploidizzate, consentono di ottenere piante omozigoti a tutti i loci, definite doppi-aploidi, di estremo interesse per lo sviluppo di ibridi F1 uniformi e spesso caratterizzati dal fenomeno di eterosi. Nel lavoro di tesi sono state applicate tecniche di coltura in vitro di antere in due specie di interesse ornamentale: Anemone coronaria L. e Ranunculus asiaticus L. Entrambe le specie sono allogame, pertanto altamente eterozigoti, e caratterizzate da un assetto cromosomico 2n=2x=16. In particolare, è stato identificato lo stadio di sviluppo del bocciolo fiorale in cui effettuare il prelievo dell'antera, sono state messe a punto tecniche di sterilizzazione delle antere e sono stati testati diversi mezzi di coltura allo scopo di ottimizzare il processo di embriogenesi pollinica. La verifica della natura aploide delle plantule rigenerate in vitro è stata effettuata mediante analisi citoflussimetrica, conteggio del numero cromosomico in tessuti meristematici di apici radicali e rilevamento di numero e dimensione delle cellule di guardia. Poiché in entrambe le specie è stata rilevata con elevata frequenza la rigenerazione di piante diploidi, allo scopo di discriminare tra piante risultato di una diploidizzazione spontanea di un embrione aploide (di-aploidi) o di un processo di embriogenesi somatica a partire da una cellula della parete dell'antera, sono stati sviluppati marcatori microsatelliti (SSR = Simple Sequence Repeats). Data l'elevata dimensione del genoma, circa 9 e 6 Gbp (1C) rispettivamente in anemone e ranuncolo, la ricerca di regioni microsatellite è stata effettuata a seguito di sequenziamento del trascrittoma di entrambe le specie e sono stati sviluppati marcatori utili a scopo diagnostico.