Modulazione dell'attività della flavina monoossigenasi umana 3 (hFMO3) attraverso la S-nitrolazione delle cisteine

INTRODUZIONE. L'ossido nitrico (NO) svolge un ruolo cruciale nella regolazione delle funzioni cellulari. Pazienti affetti da sepsi, endotossiemia o allergie di tipo I presentano un'alterazione del metabolismo dei farmaci imputabile ad un incremento dei livelli di NO. Questa piccola molecola, infatti, interagisce con le cisteine (cys) degli enzimi epatici deputati all'ossidazione delle molecole xenobiotiche tramite una reazione di S-nitrosilazione. I principali enzimi epatici coinvolti nel metabolismo dei farmaci sono i citocromi P450 e la flavina monoossigenasi umana 3 (hFMO3). SCOPO DELLA TESI. In questo lavoro di tesi è stato analizzato l'effetto della S-nitrosilazione sull'attività dell'hFMO3 utilizzando la proteina WT e un mutante cisteinico C294A. Dati di proteomica disponibili in letteratura suggeriscono, infatti, che la Cys 294 è soggetta a S-nitrosilazione. Al fine di comprendere se questa cisteina è effettivamente coinvolta nella nitrosilazione, l'attività dell'enzima è stata analizzata in presenza e assenza di donatori di NO e i dati ottenuti per il WT e il mutante sono stati comparati. RISULTATI. Le proteine (hFMO3 WT e hFMO3 C294A) sono state espresse in E. coli e purificate mediante la cromatografia a scambio ionico e d'affinità. Le Cys di entrambi gli enzimi sono state quantificate con l'ausilio del reagente di Ellman: nel WT sono state rinvenute 4.76 Cys esposte sulla superficie e nel mutante 3.90, in linea con i risultati attesi dal modello tridimensionale della proteina. Mediante il metodo switch-labeling e il saggio del consumo di NADPH, è stata valutata la S-nitrosilazione in funzione del pH (7.4 o 8.4). Con entrambe le analisi si è potuto osservare che la nitrosilazione è favorita a pH 8.4. Il saggio del consumo di NADPH ha permesso, inoltre, di confermare che la Cys 294 è coinvolta nella S-nitrosilazione in quanto per questo mutante non si registra una variazione dell'attività in presenza di donatore di NO. Infine le analisi HPLC, volte a quantificare il prodotto di reazione benzidamina N-ossido, hanno confermato l'inibizione dell'attività dell'hFMO3 WT a seguito di nitrosilazione. CONCLUSIONI. I risultati ottenuti costituiscono le prime basi biochimiche per determinare il coinvolgimento della S-nitrosilazione nel metabolismo dei farmaci ad opera dell'enzima hFMO3 e confermano il coinvolgimento diretto della Cys 294 nella modifica post-traduzionale ad opera dell'NO.