Sviluppo di una metodica isotermica (LAMP) per l'identificazione di Sarcocystis spp

Introduction: Sarcocystis includes species of Apicomplexan with a life cycle to two hosts and humans can be intermediate and definitive hosts for some of these species. The sarcocyst undergoes sexual reproduction in the intestinal epithelium and the oocysts are subsequently released in the feces of definitive hosts. At least three species, namely Sarcocystis hominis, Sarcoccystis heydorni and Sarcocystis suihominis, parasitize humans as definitive hosts and therefore as potential causes of human intestinal sarcocystosis, respectively with cattle and pigs as intermediate hosts. Despite the potential for intestinal sarcocystosis to afflict large numbers of people, the extent and importance of human sarcocystosis remain largely unknown. The objective of this study was to develop a new molecular diagnostic tool (LAMP method) to facilitate the detection of parasites in stool samples and an understanding of the epidemiology and clinical significance of Sarcocystis infections in humans. Materials and Methods: a set of five primers was designed based on the conserved region of the 18S rRNA gene of S. hominis and S. suihominis, using the PrimerExplorer V4 software. The LAMP products were monitored using electrophoresis on 2% agarose gel. They were also visually detected under UV lamp, by adding 2 μL of the amplification product to a fluorescent dye diluted 1: 1000 to the reaction tubes and by pH change detection. Samples of bovine muscle tissue (n = 10) and human feces (n = 10), positive for S. hominis were used as positive samples. Five samples of S. suihominis-positive pig muscle tissue were also used. Stool samples tested negative with conventional PCR for Sarcocystis spp. (N = 20) were included as negative samples. Results: the new LAMP protocol confirmed the results of conventional PCR for Sarcocystis spp., demonstrating, at least, the same sensitivity and specificity. The new test is therefore a rapid, simple and specific method for the detection of zoonotic Sarcocystis, while the use of colorimetric amplification visualization by detecting pH variations, simplifies the use of amplification as a molecular diagnostic tool, which allows the field diagnostics in a clear, fast and robust visual survey. Conclusion: the new test is therefore a rapid, simple and specific method for the detection of zoonotic Sarcocystis in humans Keywords: loop-mediated isothermal amplification; polymerase chain reaction; Sarcocystis; pH; colorimetric test

Introduzione: Sarcocystis comprende specie di Apicomplexa dixenici, ovvero con un ciclo vitale a due ospiti. Gli esseri umani possono essere ospiti intermedi e definitivi per alcune di queste specie. Il parassita si replica, con riproduzione sessuale, nell'epitelio intestinale e le oocisti vengono successivamente rilasciate nelle feci dagli ospiti definitivi. Almeno tre specie, vale a dire Sarcocystis hominis, Sarcocystis heydorni e Sarcocystis suihominis, parassitano gli umani come ospiti definitivi e sono, quindi, potenziale causa della sarcocistosi intestinale umana, rispettivamente con bovini e suini come ospiti intermedi. Nonostante il potenziale per la sarcocistosi intestinale di affliggere un gran numero di persone, l'estensione e l'importanza della sarcocistosi umana rimangono in gran parte sconosciute. L'obiettivo di questo studio è stato, pertanto, quello di sviluppare un nuovo strumento diagnostico molecolare (metodo LAMP) per facilitare il rilevamento dei parassiti in diverse matrici, inclusi tessuto muscolare e campioni fecali. Materiali e Metodi: Un set di cinque primer è stato progettato in base alla regione conservata del gene rRNA 18S di S. hominis e S. suihominis utilizzando il software PrimerExplorer V4. I prodotti LAMP sono stati visualizzati utilizzando elettroforesi su gel di agarosio al 2%. I risultati sono poi stati rilevati visivamente con lampada UV, aggiungendo 2 μL del prodotto di amplificazione ad un colorante fluorescente diluito 1: 1000 e mediante rilevazione della variazione di pH, con l'aggiunta, nel mix di reazione, di un rilevatore di pH. Sono stati usati come campioni positivi campioni di tessuto muscolare bovino (n = 10) e di feci umane (n = 10), positivi per S. hominis. Sono inoltre stati utilizzati 5 campioni di tessuto muscolare di suino positivo per S. suihominis . I campioni di feci e tessuto muscolare, risultati negativi con la PCR convenzionale per Sarcocystis spp. (N = 20), sono stati inclusi come campioni negativi. Risultati: il nuovo protocollo LAMP ha confermato i risultati della PCR convenzionale per Sarcocystis spp., dimostrando, almeno, la stessa sensibilità e specificità. Il nuovo test è quindi un metodo rapido semplice e specifico per la rilevazione delle specie sarcosporidiche zoonotiche. L'utilizzo della visualizzazione colorimetrica dell'amplificazione rilevando le variazioni di pH, inoltre, semplifica l'uso di questa tecnica come strumento diagnostico molecolare, consentendo la diagnostica sul campo in modo chiaro, rapido e robusto. Conclusioni: Il nuovo test è quindi un metodo rapido, semplice e specifico per la raccolta di dati volti alla comprensione dell'epidemiologia ed il significato delle infezioni causate da Sarcocystis nell'uomo e negli animali. Keywords: amplificazione isotermica; reazione a catena della polimerasi; Sarcocystis; pH; test colorimetrico