Ottimizzazione di una real-time PCR quantitativa per la ricerca dei principali patogeni responsabili della Sindrome da malassorbimento nei polli da carne

La Sindrome da malassorbimento o Runting Stunting Syndrome (RSS) è una patologia enterica che affligge i polli da carne e provoca gravi perdite economiche nel settore dell'avicoltura globale. Si tratta di una sindrome multifattoriale che colpisce gli animali nelle prime due settimane di vita, determinando primariamente ritardo di accrescimento e feci diarroiche. Molteplici famiglie virali sono state identificate come agenti di RSS e tra le principali vi è la famiglia Astroviridae. I membri di questa famiglia che colpiscono il pollo sono il Chicken Astrovirus (CAstV) e l'Avian Nephritis Virus (ANV). Questi virus sono stati isolati anche in polli clinicamente sani. Inoltre, alcune varianti sono state recentemente associate a problemi in incubatoio. Data la scarsità di studi sull'argomento, attualmente non si possiedono esaustive conoscenze riguardo al ruolo degli astrovirus nella patogenesi della RSS e soprattutto alla carica virale necessaria a scatenare l'insorgenza della sintomatologia clinica. Questo lavoro si è posto l'obiettivo di mettere a punto un protocollo di real-time RT-PCR quantitativa in grado di fornire un supporto diagnostico solido per l'identificazione degli astrovirus del pollo, data la mancanza al momento di protocolli specifici e universalmente condivisi. Il protocollo ottimizzato è stato successivamente utilizzato per testare campioni prelevati in un incubatoio piemontese al fine di valutare il ruolo che questo tipo di struttura può avere nella trasmissione del patogeno e per dimostrare la reale possibilità di una trasmissione verticale. Per la messa a punto del metodo si è resa necessaria l'analisi bibliografica di tutti i protocolli presenti negli articoli scientifici e delle sequenze genomiche attualmente depositate nella banca dati online GenBank. Sono stati effettuati gli allineamenti delle sequenze nucleotidiche con BioEdit e questo ha permesso di evidenziare i primers più performanti. Partendo dall'unico protocollo real-time RT-PCR descritto in letteratura con un buon tasso di successo nell'identificazione di questi virus, sono state eseguite numerose prove per ottimizzare il saggio e per renderlo quantitativo. A tal fine è stato fondamentale generare una curva standard e procedere al clonaggio del frammento amplificato in vettore procariotico. Per l'ottimizzazione del metodo è stato utilizzato come controllo positivo un pool di contenuto intestinale prelevato da pulcini risultati infetti. Sono state testate diverse tipologie di campioni prelevati in incubatoio, tra cui cartine sporche di feci di pulcini di un giorno, tamponi ambientali e sacchi vitellini di embrioni al 18esimo giorno di incubazione. Nonostante le concrete difficoltà riscontrate nel processo di ottimizzazione, sono stati raggiunti risultati promettenti. L'analisi dei parametri della real-time RT-PCR ha evidenziato un valore di efficienza elevato (>110%) problema che può essere associato a errori procedurali o più probabilmente ai primers degenerati. Il disegno dei primers ad-hoc per le sequenze circolanti sul territorio piemontese permetterà di risolvere questa problematica. I test effettuati hanno rilevato positività in pulcini di 1 giorno, in sacchi vitellini prelevati in ovo e in contenuto intestinale di broiler nonché la negatività di tutti i tamponi ambientali eseguiti in incubatoio. I dati permettono di escludere l'incubatoio come fonte di trasmissione e di consolidare l'ipotesi di una possibile trasmissione verticale.