Sintesi di sonde fluorescenti a struttura 1,4-diidropiridinica per il live cell labeling dei canali del calcio di tipo-L

L-type calcium channels (LTCCs) are involved in important physiological processes such as lightning-fast thinking, muscle twitching and heartbeat. Hence, changes in the expression and functional modifications of LTCCs are linked to severe pathological conditions, such as Timothy Syndrome (TS) and hypertrophic obstructive cardiomyopathy among others. Moreover, recent studies suggest that malfunction in LTCCs, in particular in Cav1.2 and CaV1.3, is linked to Alzheimer's and Parkinson's disease. Even though they have a paramount role in all-important human pathologies, there is still a lack of non-invasive techniques for the visualization of these channels. Current understanding of CaV function is shaped on electrophysiological studies, 3H-radiolabeled inhibitors, and immunohistochemical studies on fixed samples. Although, green fluorescent protein (GFP) labeling represents a viable alternative for studying individual LTCCs, it appears that attachment of the former to transmembrane ion channels highly influences their membrane expression and conduction properties. Therefore, high precision tool development that allows a better understanding of LTCCs, with potential use in in vivo studies is highly desired. In order to meet these needs, we report the development of new fluorescent probes for LTCCs, based on a 1,4-dihydropyridine (1,4-DHP) backbone, as optimal tool to further enhance current pathophysiological understanding. Furthermore, the newly synthesized fluorescent ligands could potentially substitute 3H-radiolabeled 1,4-DHPs, thus overcoming current drawbacks as their licensing for use and disposal. The 1,4-DHP scaffold was chosen as backbone structure for the development of these new probes since 1,4-DHPs are the largest class of LTCC ligands, providing a plethora of derivatives including both agonists and antagonists. We report the synthesis and characterization of seven new racemic probes combining diverse 1,4-DHP backbones (nifedipine and felodipine), with four different linkers (both alkyl- and PEG-based) and two fluorophores (Cy5 and BODIPY FL). Moreover, in view of the opposite activity of the Bay K 8644 enantiomers, we tried to optimize the synthesis of both the separate enantiomers as well, in order to evaluate the differences between agonist-like and antagonist-like probes, even if no final compound was isolated. Characterization and structural determination of our fluorescent ligands includes NMR and HR-MS. The purification of the final compounds was performed via HPLC. Biological tests include confocal microscopy on SHSY5Y cells, with competition experiments, and Ca2+ imaging studies on myotubes, to probe the binding of our 1,4-DHP-based fluorescent ligands by measuring Ca2+ release. As expected, the observed reduction of Ca2+ release was comparable to the one of nifedipine and felodipine. Further studies are still needed to evaluate the potential of these compounds as probes, but a small library of new fluorescent 1,4-DHPs has been generated that could be an important step on the way to new fluorescent probes for LTCCs.

I canali del calcio di tipo L (LTCC) sono coinvolti in importanti processi fisiologici, tra cui la trasmissione rapida del pensiero, la contrazione muscolare e il battito cardiaco. Una variazione nell'espressione degli LTCC o una perdita di funzionalità degli stessi comporta l'insorgenza di gravi condizioni patologiche, tra le tante la sindrome di Timothy e la cardiomiopatia ipertrofica ostruttiva. In più, studi recenti suggeriscono che anomalie nel funzionamento degli LTCC, in particolare Cav1.2 e CaV1.3, siano correlati con la malattia di Alzheimer e con il morbo di Parkinson. Sebbene il loro ruolo in patologie di ampia diffusione sia fondamentale, si evidenzia ancora una carenza nello sviluppo di tecniche non invasive per la visualizzazione di questi canali. Al giorno d'oggi lo studio dei canali del calcio voltaggio dipendenti si basa principalmente su esperimenti di elettrofisiologia, sull'utilizzo di inibitori radiomarcati (3H-1,4-diidropiridine) e su studi immunoistochimici. Sebbene il labeling tramite proteine verdi fluorescenti (GFP) sia un'alternativa percorribile per lo studio a livello molecolare degli LTCC, sembra che l'attacco delle GFP ai canali ionici transmembrana ne influenzi in modo importante l'espressione e le proprietà di conduzione. Di conseguenza, é altamente ricercato lo sviluppo di strumenti ad alta precisione, specialmente con possibilità di applicazione in studi in vivo che permettano una maggiore comprensione degli LTCC. Per andare incontro a queste necessità, si riporta lo sviluppo di nuove sonde fluorescenti per gli LTCC, basate sullo scheletro delle 1,4-diidropiridine (DHP) come strumento ottimale per favorire lo studio patofisiologico di questi canali. Queste sonde di nuova sintesi potrebbero potenzialmente sostituire le DHP radiomarcate con il trizio, superando gli inconvenienti legati all'autorizzazione all'uso e allo smaltimento. Lo scaffold delle DHP è stato scelto come struttura base per lo sviluppo di queste nuove sonde. Le DHP sono infatti la più ampia classe di ligandi per gli LTCCs, e comprendono una grande varietà di derivati, tra cui sono inclusi sia agonisti che antagonisti. Viene descritta quindi la sintesi e la caratterizzazione di sette nuove sonde non enantiopure, in cui le strutture base di diverse DHPs (nifedipina e felodipina) vengono combinate con quattro diversi linker (a base alchilica o polietilenglicolica) e con due diversi fluorofori (Cy5 and BODIPY FL). Inoltre, essendo noto che gli enantiomeri di Bay K 8644 presentano attività opposta, abbiamo ottimizzato la sintesi di entrambi gli enantiomeri, in modo da valutare eventuali differenze tra sonde con attività agonista e sonde con attività antagonista, anche se nessun composto finale é stato isolato. La purificazione del composti finali é stata ottenuta via HPLC. I test biologici includono studi di Ca2+ imaging su miotubi per verificare il binding delle nostre sonde fluorescenti a struttura 1,4-diidropiridinica misurando l'influsso del Ca2+. Come previsto, la riduzione dell'influsso del Ca2+ é paragonabile a quella ottenuta con nifedipina e felodipina. Successivamente, un rapido screening di diversi tempi di incubazione e diverse dosi é stato effettuato su cellule del tipo SH-SY5Y per definire le migliori condizioni per la microscopia confocale. Ulteriori studi sono ancora necessari per valutare il potenziale di questi composti come sonde.