Alterazione dell'eccitabilità neuronale in colture ippocampali di topi TS2-NEO affetti dalla sindrome di Timothy indotta dalla mutazione G406R del canale del calcio Cav1.2

The Timothy Syndrome (TS) is a rare genetic multi-organ dysfunction caused by the de novo missense mutation of the &#945;1-subunit of Cav1.2 voltage-gated calcium channel encoded by CACNA1C gene [1].The mutation, thus, leads to massive Ca2+entry during prolonged cell depolarizations and Ca2+ overload.The Cav1.2 channel is localized in a wide range of organs such as brain, endocrine glands, heart, smooth and skeletal muscle [2].TS results from the mutation of a Glycine to Arginine in position 406 (G406R) on exon 8 (TS2) and it is characterized by: webbing of the fingers and toes (syndactyly), immune deficiency, intermittent hypoglycaemia, congenital heart disease (long-QT syndrome and cardiac arrhythmias, abnormally prolonged cardio-myocyte APs, hypertrophic cardiomyopathy, AV-blocks), cognitive abnormalities and autism.In this work, we used a murine model of TS2 that exhibits the G406R mutation on exon 8 protected by a neomycin cassette (TS2-NEO), which allows the animal to survive [3]. Experiments were carried out by means of the microelectrode array (MEA) technology, monitoring extracellular electrical spontaneous activity in hippocampal neurons of mice carrying the TS2-NEO mutation and WT [4]. Spontaneous firing of hippocampal neurons was monitored for up to 18 days after plating.We compared TS2-NEO cultures spontaneous activity to the WT, in order to characterize the network activity during development in the two experimental groups. In young cultures (7DIV, from n= 8 cultures), we observed that there was a significant reduction in the firing frequency of TS2-NEO cultures (0,27&#61617;0,02Hz, n= 656 channels), compared to WT cells (0,46&#61617;0,03Hz, n= 754 channels; p<0,001, using Student's paired t-test). In elder cultures (18 DIV, from n= 5 cultures) we did not reveal any significant difference of the electrical activity between WT and TS2-NEO cultures (0,57&#61617;0.03Hz, n= 978 channels, and 0,61&#61617;0,03Hz, n= 736 channels respectively; p> 0,05, using Student's paired t-test). In order to better characterize the firing pattern of TS2-NEO cultures, we also performed a series of experiments using the patch-clamp technique, in current-clamp configuration, to record either single or trains of action potentials. The current-clamp results supported the data obtained with the MEAs: during the early stages of development (3-7DIV), only 50% of TS2-NEO showed electrical activity (n=21cells), while 100% of WT was active (n=11cells). No significant differences between TS2-NEO and WT in elder cultures were found (>8DIV, in n= 11 TS2-NEO neurons, n= 9 WT coltures).In conclusion, the marked difference showed by TS2-NEO and WT hippocampal cultures during early stages suggests that autistic forms of disorder may originate from key alterations of neuronal excitability in hippocampal and neo-cortical networks during the early days of neuronal development.This could be due to a calcium influx excess during prolonged cell depolarization associated with the Cav1.2 channel gating alteration and consequent change of action potential shape that may eventually leads to altered cell firing and neuronal microcircuits development [5]. The absence of significant differences between TS2-NEO and WT in elder cultures could be attributed to a mechanism of excitatory/inhibitory synaptic compensation during neuronal networks maturation. A second hypothesis could be that cells in TS2-NEO cultures undergo apoptosis during development, thus leading to a similar pattern of electrical activity.

La sindrome di Timothy (TS) è una rara malattia genetica non ereditaria causata dalla mutazione puntiforme a carico della subunità &#945;1 del canale del calcio di tipo L Cav1.2, codificato dal gene CACNA1C [1]. L'alterazione della subunità &#945;1, che forma il poro del canale, determina una diminuzione dell'inattivazione del canale ionico ed un conseguente aumento dell'influsso di ioni calcio all'interno delle cellule in cui il canale è altamente espresso (cuore, cervello, muscolo liscio, surrene), determinando gravi problemi cardiaci, disfunzioni cognitive ed autismo [2]. In questo lavoro abbiamo studiato gli effetti che la mutazione comporta in termini di eccitabilità cellulare in neuroni ippocampali di topo wild-type (WT) o di topo eterozigote recante la mutazione G406R con aggiunta una cassetta genica di neomicina sull'esone 8 (TS2-NEO), al fine di consentirne la sopravvivenza [3].Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando matrici di micro-elettrodi (MEA, microelectrode array) per registrare l'attività elettrica spontanea a livello extracellulare [4]. Le registrazioni sono state effettuate a diversi giorni in vitro (DIV) per poter monitorare la maturazione della rete neuronale nei due gruppi sperimentali. Dalle registrazioni effettuate su colture di soli 7 DIV (n= 8 colture totali) è emersa una significativa diminuzione della frequenza dell'attività elettrica spontanea nelle cellule TS2-NEO (0,27&#61617;0,02Hz, n= 656 canali) rispetto ai WT (0,46&#61617;0,03Hz, n= 754 canali; p<0,001, usando il test-t di Student per campioni non appaiati).In colture più mature (18 DIV, n= 6 colture totali) non abbiamo riscontrato differenze significative tra TS2-NEO e WT a livello di attività elettrica extracellulare (0,57&#61617;0.03Hz, n= 978 canali e 0,61&#61617;0,03Hz, n= 736 canali rispettivamente; p> 0,05, usando il test-t di Student per campioni non appaiati). Per poter caratterizzare in modo più completo l'attività elettrica dei neuroni ippocampali abbiamo effettuato anche una serie di registrazioni con la tecnica del patch-clamp, in configurazione di current-clamp. Le registrazioni dei potenziali d'azione a livello intracellulare hanno mostrato che, nei primi stadi di maturazione (3-7 DIV), solo il 50% delle cellule TS2-NEO (n= 21 cellule) presenta attività elettrica rispetto al 100% nei WT (n= 11 cellule). Non è emersa, invece, alcuna differenza tra i due gruppi nelle colture mature (> 8DIV, n= 11 cellule TS2-NEO e n=9 cellule WT). Tali dati risultano in buon accordo con i dati ottenuti con i MEA.La presenza di una marcata differenza tra neuroni WT e TS2-NEO negli stadi iniziali di sviluppo e maturazione suggerisce che le alterazioni dell'eccitabilità, e quindi del funzionamento neuronale che inducono forme di autismo, ha verosimilmente origine nei primissimi stadi di sviluppo delle reti neuronali ippocampali e possibilmente neo-corticali. Ciò potrebbe essere dovuto all'aumentato ingresso di calcio durante depolarizzazioni sostenute, indotto dall'alterazione di Cav1.2, accompagnato dal conseguente cambiamento di forma dei potenziali d'azione, che determina profondi effetti sulla comunicazione neuronale [5]. L'assenza di differenze statisticamente significative nelle colture TS2-NEO e WT mature potrebbe essere legata a un meccanismo di compensazione adottato dalla rete neuronale matura oppure a un fenomeno di apoptosi a cui vanno incontro le cellule mutate nelle colture ottenute da topi TS2-NEO eterozigoti, che porterebbe quindi ad uniformare l'attività dei due gruppi.