Purificazione e caratterizzazione dell'enzima umano HSD17B7

L'enzima 17β-idrossisteroide-deidrogenasi tipo 7 (HSD17B7) agisce come zimosterone reduttasi e come tale è coinvolto nella fase post-squalenica della biosintesi del colesterolo. Dati scientifici mostrano che in modelli murini una carenza di questo enzima provoca effetti teratogeni, dovuti probabilmente all'accumulo di alcuni intermedi di sintesi.1 Sono già noti alcuni ¿disordini metabolici¿ a carico di mutazioni presenti su geni di due degli enzimi del complesso di demetilazione in C-4 degli steroli, a cui appartiene la stessa HSD17B7.2 Inoltre, l'enzima catalizza la riduzione dell'estrone inattivo nella sua forma biologicamente attiva, l'estradiolo, e come tale riveste un ruolo importante in patologie estrogeno-dipendenti come il cancro mammario e ovarico.3 Per quest'ultima ragione l'enzima HSD17B7 è diventato un promettente target per farmaci antitumorali. Lo sviluppo di potenziali inibitori per l'attività estrogeno-reduttasica risulta però complesso a causa delle poche conoscenze che si hanno su quest'enzima. Si tratta infatti di un enzima di membrana, non solubile, di cui non si conosce la struttura non essendo mai stato cristallizzato. Lo scopo del presente progetto è stato quello di mettere a punto un metodo di purificazione e solubilizzazione dell'enzima, in modo da poter effettuare un'iniziale caratterizzazione funzionale e eventualmente anche la sua cristallizzazione. Inizialmente, il gene di HSD17B7 è stato clonato nel vettore pMht, fuso con sei residui di istidina e con la Maltose binding protein (MBP), utilizzata come proteina carrier per aumentare la solubilità dell'enzima. Il vettore ricombinante così ottenuto è stato usato per trasformare le cellule batteriche BL21 codon plus (DE3). Dopo l'espressione della proteina, le cellule batteriche sono state risospese in un tampone fosfato 100 mM, pH 8, contenente 10% glicerolo, 10 mM glutatione ridotto, lisozima e benzonasi. La sospensione è stata sonicata e sottoposta a centrifugazione. Il pellet ottenuto è stato risospeso nello stesso tampone contenente glicerolo e glutatione ridotto, nuovamente sonicato e la sospensione ottenuta centrifugata. La procedura è stata ripetuta una terza volta. Le frazioni solubili sono state analizzate tramite elettroforesi SDS-PAGE ed è stata rilevata la presenza dell'enzima in esse. Queste frazioni sono state poi purificate usando la resina al Cobalto, al fine di chelare i residui di istidina presenti sull'enzima ricombinante, e analizzate tramite elettroforesi SDS-PAGE. L'attività estrone-reduttasica e zimosterone-reduttasica dell'enzima in soluzione è stata testata incubando le frazioni solubili con i rispettivi substrati, estrone e 4-metilzimosterone. I prodotti di reazione, estradiolo e il 4-metilzimosterolo, sono stati visualizzati tramite cromatografia su strato sottile. L'enzima è risultato attivo per entrambe le attività. Inoltre l'inibitore 10, fornito dal Prof. Poirier è stato testato su entrambe le attività reduttasiche della HSD17B7 in soluzione e questo è risultato attivo solo sull'attività 17-chetosteroide-reduttasica. Questo avvalora l'ipotesi che la doppia attività catalitica della proteina possa dipendere dall'esistenza di due siti attivi differenti.