Inglobamento di Bevacizumab in nanoparticelle lipidiche: caratterizzazione e studi di stabilità

Bevacizumab (BVZ) is a humanized monoclonal antibody, of the IgG1 type, which is used as an anti-angiogenic factor. The antibody prevents the interaction between the vascular endothelial growth factor VEGF-A and its receptors with tyrosine-kinase activity Flt1 and Flk-1/KDR. The binding of BVZ to VEGF-A receptors (located on the surface of endothelial cells) inhibits the activation of molecular signaling pathways, leading to cell proliferation and to the formation of new blood vessels. The off-label use of BVZ, is relevant for the treatment of vascular retinal diseases, such as diabetic retinopathy and degenerative maculopathy [1,2]. Treatment of these diseases involves intravitreal administration of BVZ, with a low compliance for the patients. This project was focused on the formulation of lipid nanoparticles (NPs), as a drug delivery system of BVZ to obtain a prolonged release of the molecule over time and thus reduce the number of administrations. The development of NPs involved the use of approved ingredients for ocular administration, to guarantee the final system tolerability. These systems were obtained with the method called ¿cold dilution of micro emulsions¿, which involves the preparation of a micro emulsion composed of a solid lipid dissolved in an organic solvent, partially soluble in water, a mixture of surfactants/cosurfactants, and an aqueous phase. The subsequent dilution with water determines the precipitation of the lipid as a nanoparticulate matrix. To increase the lipophilicity of BVZ and promote its incorporation into NPs, a counter-ion named sodium dioctylsulfosuccinate (AOT) was used. AOT thanks to its sulfonate group, which is anionic at physiological pH, interacts with the protonated basic groups of the amino acids of the antibody. The nanoparticulate systems obtained were characterized by observation with an optical microscope and a scanning electron microscope (SEM); the mean diameter (250-350 nm), the dimensional stability at 4 ° C for 30 days and the Zeta potential were measured. The incorporation of the drug in the NPs (about 50%) was determined both by a SDS_PAGE electrophoretic analysis of free drug's fractions and those associated with the NPs, and by an HPLC analysis of the fractions containing the free drug. The analyzed fractions were obtained using a purification process by size-exclusion chromatography. Particular attention was paid to the verification of the structural integrity of BVZ, which could undergo alterations during the formulation steps, because of the interaction with some components of the NPs. It has been found, by circular dichroism, that the antibody' s secondary structure is almost unchanged, even though with slight modifications. Moreover, performing a gel-filtration and subsequent electrophoresis, the formation of protein aggregates was excluded.

Il Bevacizumab (BVZ) è un anticorpo monoclonale umanizzato, del tipo IgG1, che trova impiego come fattore anti-angiogenetico. L'anticorpo impedisce l'interazione tra il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A ed i suoi recettori ad attività tirosin-chinasica Flt1 e Flk-1/KDR. Il legame del BVZ ai recettori del VEGF-A (situati sulla superficie delle cellule endoteliali) inibisce l'attivazione di vie di segnalazione molecolari, che portano alla proliferazione cellulare e alla formazione di nuovi vasi sanguigni. Di particolare interesse risulta l'utilizzo off-label del BVZ, ossia l'impiego per il trattamento di patologie vascolari della retina, come la retinopatia diabetica e la maculopatia degenerativa [1,2]. Il trattamento di tali patologie prevede la somministrazione intravitreale del BVZ con scarsa compliance da parte dei pazienti. Questo progetto di tesi si è focalizzato sulla formulazione di nanoparticelle lipidiche (NP), come sistema di drug delivery del BVZ per ottenere un rilascio prolungato della molecola nel tempo e ridurre quindi il numero di somministrazioni. Lo sviluppo delle NP ha previsto l'utilizzo di ingredienti approvati per la somministrazione oculare, al fine di garantire la tollerabilità del sistema finale. Tali sistemi sono stati ottenuti con la tecnica di diluizione a freddo di microemulsioni, che prevede la preparazione di una microemulsione composta da un lipide solido disciolto in un solvente organico, parzialmente solubile in acqua, una miscela di tensioattivi/cotensioattivi, e una fase acquosa. La successiva diluizione della microemulsione con acqua, determina la precipitazione del lipide solido sotto forma di matrice nanoparticellare. Per aumentare la lipofilia del BVZ e favorirne l'incorporazione nelle NP, è stato utilizzato il diottilsolfosuccinato di sodio (AOT) come controione. L'AOT, grazie al suo gruppo solfonato, anionico a pH fisiologico, interagisce con i gruppi basici protonati delle catene laterali amminoacidiche dell'anticorpo. I sistemi nanoparticolati ottenuti sono stati caratterizzati mediante osservazione al microscopio ottico e al microscopio elettronico a scansione (SEM); è stato determinato il diametro medio (250-370 nm), la stabilità dimensionale a 4 °C per 30 giorni e il potenziale Zeta. L'inglobamento del farmaco all'interno delle NP (circa 50%) è stato determinato sia con un'analisi elettroforetica mediante SDS_PAGE delle frazioni di farmaco libero ed associato con le NP sia con un'analisi HPLC delle frazioni di farmaco libero. Le frazioni analizzate sono state ottenute in seguito al processo di purificazione mediante cromatografia per esclusione molecolare. Particolare attenzione è stata riservata alla verifica dell'integrità strutturale del BVZ, che potrebbe subire alterazioni durante gli steps formulativi, per l'interazione con alcune componenti delle NP. Tramite dicroismo circolare è stato riscontrato come l'anticorpo abbia mantenuto pressoché inalterata la sua struttura secondaria, seppur con lievi modifiche. Inoltre, sfruttando una gel-filtrazione e successiva elettroforesi, è stata esclusa la formazione di aggregati proteici. 1) A. Klein, A. Loewenstein; . Terapeutic Monoclonal Antibodies. and Fragments: Bevacizumab . Retinal Pharmacotherapeutics. Dev Ophtalmol. 2016; Volume 55; pp 232-245 2) N. Ferrara, K.J. Hillan, W. Novotny; . Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy . Biochemical and Biophysical Research Communications.