Progettazione e sintesi di nuove entità chimiche come inibitori dell'attività ATPasica dell'inflammasoma NLRP3

L'inflammasoma NLRP3 è una proteina multimerica e assume un ruolo chiave nell'attivazione della caspasi-1 intracellulare, nella maturazione dell'interleuchina pro-infiammatoria IL-1β, dell'IL-18 e della cascata di morte cellulare piroptotica. L'iperattivazione di NLRP3 è coinvolta in diverse malattie, tra cui le malattie infiammatorie dell'intestino (IBD), le criopirinopatie, il diabete di tipo 2, le malattie di Alzheimer e Parkinson, la sclerosi multipla, la gotta e molti altri. Le vie di segnalazione correlate all'inflammasoma NLRP3 stanno emergendo come promettenti target nella scoperta di farmaci. In un precedente lavoro, il nostro gruppo di ricerca dimostrò che i derivati carbonilici α-β insaturi, presentanti un accettore di Michael, possono prevenire significativamente la piroptosi dipendente da NLRP3 delle cellule THP-1 e questo effetto fu associato con l'inibizione dell'attività dell'ATPasi di NLRP3. L'attività ATPasica assume un ruolo centrale nei cambi conformazionali di NLRP3 che conducono alla sua oligomerizzazione in associazione con ASC-speck ed al clivaggio attivante della procaspasi-1, coinvolta nella maturazione dell'IL-1β. In precedenti studi il nostro gruppo sviluppò i composti 1-4 che dimostrarono dose dipendenza e inibizione irreversibile dell'attività ATPasica di NLRP3 ricombinante isolato. In aggiunta, la modalità di legame di 4 fu predetta con studi computazionali. L'obiettivo di questa tesi fu: (i) costruire una robusta relazione struttura-attività attorno alla struttura del composto 7 attraverso adeguate variazioni; (ii) aumento dell'affinità nei confronti del target biologico; (iii) identificazione di composti non citotossici per ulteriori studi; (iv) ottimizzazione delle proprietà drug-like delle strutture identificate per la penetrazione predetta della barriera ematoencefalica e la disponibilità orale.

NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex playing a key role in the intracellular activation of the innate immune system through activating cleavage of pro-inflammatory interleukins (IL)-1β, IL-18 induced by caspase-1 and triggering of pyroptotic cell death. The overactivation of NLRP3 is implicated in a variety of diseases, including inflammatory bowel disease (IBD), cryopyrin associated periodic syndromes, type 2 diabetes, Parkinson's and Alzheimer's diseases, multiple sclerosis, gout, and many others.1 The NLRP3 inflammasome is emerging as a promising drug target, unfortunately, so far, small molecules able to selectively inhibit the NLRP3 activation are not available. After sensing danger-associated molecular patterns (DAMPs) the NLRP3 inflammasome is activated and assembled into a multimeric complex. The assembly of NLRP3 is driven by the ATPase activity present in its NACHT domain. It has been proposed that molecules able to selectively block the NLRP3 ATPase activity can prevent inflammasome function. In a previous work, we identified a small molecule able to inhibit the NLRP3 ATPase activity at 50 µM through covalent binding with the target protein, as well as non-covalent inhibitors acting as partial inhibitors on the same target.2 Using a fragment-based approach in this thesis we identified a new hit compound (7) able to inhibit the ATPase activity of isolated recombinant human NLRP3 (rh NLRP3) in vitro. The structure of 7 was then chemically modulated in order to: (i) increase the inhibitory activity, (ii) draw a SAR profile, (iii) modulate the cytotoxic properties. Six series of compounds were synthesised, each series corresponding to a different modulation of the hit structure 7. To speed-up the discovery process, compounds were synthesised through short synthetic routes of max 5 steps. Twenty-one new chemical entities were obtained and screened for their ability to inhibit rh-NLRP3 activity in vitro. From this screening compounds 14, 21, 26, and 27 emerged as the most promising inhibitors; in particular, compounds 14 and 21 did not show any cytotoxicity up to 100 µM. and may represent new molecular leads for the development of selective NLRP3 ATPase inhibitors. Compound 21 also showed a dose-dependent inhibition of the rh-NLRP3 ATPase with a calculated IC50 of 17.2 M (15.4 - 19.2 C.L. 95%) behaving as an allosteric inhibitor and may represent a new molecular lead for the development of selective NLRP3 ATPase.