AA6, inibitore dell'α-chetoglutarato deidrogenasi, diminuisce la formazione di metastasi nel tumore mammario

Breast cancer is a developing threat women face worldwide. The disease is characterized by about 20% incidence of metastasis, mainly in bone, distant soft tissue and lung. The hyperactive metabolism of cancer cells supports their extreme adaptability and plasticity and facilities resistance to common anticancer therapies. Recently, a broad interest pointed to cancer metabolism as a promising target to develop new therapeutic approaches. In this study, we evaluated the antimetastatic effect of the recently described α-ketoglutarate dehydrogenase (α-KGDH) inhibitor, (S)-2-[(2,6-dichlorobenzoyl) amino] succinic acid (AA6) on breast cancer development. We analyzed AA6 properties in vitro with different tests on human cancer breast cells (MDA-MB-231 and CRL-2335) and a mouse cancer cell line (4T1) by performing: a) cell adhesion assay, cell motility assay in Boyden chamber and scratch assay for evaluating the anti-invasiveness and the antimigration effect; b) MTT assay and Colony-forming assay to investigate the antiproliferative effect; c) in vivo effect; d) metastasis RT2 profiler PCR array to quantify the expression of a selected panel of genes associated with tumor progression and metastasis; e) ELISA assay to monitor the ten-eleven traslocation hydroxylases (TET) activity from the levels of 5-methyl cytosine and 5-methylhydroxy cytosine. An orthotopic mouse model of 4T1 breast cancer was used to evaluate the breast cancer development (AA6 50 mg/kg). Immunofluorescence, confocal microscopy and immunohistochemistry were performed to analyze Ki67, marker of proliferating cells and caspase 3, marker of apoptosis. The most important in vitro effects of AA6 on 4T1 cells were observed at 50 µM, with a tumor cell migration impairment higher than 80%, in parallel to a significant inhibition of invasiveness. Similar results were obtained in the other two human breast cell lines CRL-2335 and MDA-MB-231, in which AA6 reduced serum-stimulated chemo-attraction and adhesion to TNF-α-activated endothelium. In agreement with in vitro observations, the treatment of 4T1 mice with a AA6, significantly decreased the incidence of lung metastasis, without affecting the growth of the primary tumor; indeed, AA6 was not able to affect in vitro cell proliferation or survival. The analysis of the expression of a selected panel of genes associated with tumor progression and metastasis revealed that some crucial metastatic genes were negatively modulated by AA6 (MMP3 and GPNMB genes) with a minor effect on cell proliferation genes. Finally, the ELISA quantification of 5mC e 5hmC confirmed the hypothesis that the inhibition of α-KGDH, induced by AA6, could increase the activity of the α-KG dependent epigenetic enzymes, including the TETs. This work was recently published by Cell Death & Disease (Atlante et al., 2018); it demonstrates that AA6 might be correlated to: a) modulation of mitochondrial metabolism, such as the alteration of Krebs cycle, that induce intracellular α-ketoglutarate (α-KG) accumulation; b) TET activation; c) effect on endogenous NO synthesis. This experimental evidences suggested that α-KGDH complex might function as a key metabolic enzyme during metastatic progression and that AA6 counteracts this process. In conclusion, we provide here AA6 as a novel molecule, which could be able to counteract breast cancer-associated metastasis.

Il tumore mammario rappresenta una minaccia globale per le donne, dato che nel 20% dei casi induce la formazione di metastasi, alle ossa, ai tessuti molli ed ai polmoni. Poiché l'iperattivazione del metabolismo delle cellule tumorali ne migliora l'adattabilità nel microambiente, negli ultimi anni molta ricerca si è focalizzata sul metabolismo tumorale, promuovendolo come possibile target per nuovi approcci terapeutici. Lo scopo del lavoro è stato quello di esaminare l'effetto antimetastatico di AA6, recentemente identificato come inibitore dell'α-ketoglutarato deidrogenasi (α-KGDH), sul cancro alla mammella. Abbiamo analizzato le proprietà di AA6, su tre linee cellulari di tumore mammario, MDA-MB-231 e CRL-2335 (umane) e 4T1 (murine) con molteplici test in vitro, per valutare l'effetto: a) sull'invasività tumorale mediante il Test dell'adesione cellulare, della migrazione in camera di Boyden e della migrazione orizzontale con il Test del Wound Healing; b) antiproliferativo, utilizzando il Test dell' MTT e il Test della formazione delle colonie; c) sull'effetto in vivo; d) sull'espressione di geni associati ai processi di progressione e metastasi tumorale, utilizzando la ¿RT2 profiler PCR array¿; e) sulla riattivazione delle proteine TET e sulla variazione dei livelli di 5-metil citosina e 5-metilidrossi citosina mediante il Test ELISA. Per studiare l'evoluzione tumorale dopo trattamento con AA6 (50 mg/kg) in vivo, è stato utilizzato un modello ortotopico murino di tumore mammario, utilizzando le 4T1; l'immunofluorescenza, la microscopia confocale e l'immunoistochimica sono stati utilizzati per analizzare Ki67 e Caspasi3, marker di proliferazione cellulare e di apoptosi. Innanzitutto, è stato dimostrato che AA6 non inibisce la crescita delle cellule tumorali in nessuna linea trattata. AA6 50 µM è però risultato in grado di ridurre dell'80%, sia la migrazione che l'invasività di tutte le linee trattate. In accordo con questi dati, AA6 è in grado di modulare negativamente l'espressione di geni importanti nel processo metastatico, tra cui MMP3 e GPNMB. I risultati ottenuti in vivo confermano quelli in vitro, infatti, nei topi trattati con AA6 è stata riscontrata una significativa riduzione delle metastasi polmonari, senza alcuna modificazione del tumore primario. Infine, i risultati ottenuti sulla quantificazione dei livelli di 5mC e 5hmC, hanno confermato l'ipotesi che l'inibizione del complesso enzimatico α-KGDH, indotta da AA6, potrebbe esser associata all'aumento dell'attività di alcuni enzimi α-KG dipendenti, come le proteine TET. Questo articolo è stato recentemente pubblicato su Cell Death & Disease (Atlante et al., 2018); è stato proposto che l'effetto di AA6 sia correlato a differenti meccanismi d'azione, come la modulazione del metabolismo mitocondriale (es. l'alterazione del ciclo di Krebs con conseguente accumulo intracellulare di α-ketoglutarato); l'attivazione delle proteine TET; o anche l' effetto positivo sulla sintesi endogena di NO. I risultati hanno portato a ipotizzare che l'α-KGDH possa funzionare come enzima metabolico chiave durante la progressione metastatica del tumore e che AA6 possa dunque ritardare tale processo. In conclusione, questo studio propone AA6 come nuova molecola in grado di contrastare la formazione di metastasi associate allo sviluppo del cancro mammario.