Development of a screening strategy to assess muscle atrophy inducers

Cancer cachexia is known to significantly affect the quality of life of patients. In vitro, the evaluation of muscle wasting in vitro mainly relies on C2C12 fiber diameter measurements. However, such a technique presents several limitations (e.g. time-consuming, highly subjective etc). For this reason, we developed and validated an innovative procedure to standardize and automate the measurement of myotube diameters in order to identify tumor-secreted factors in human colorectal cancer conditioned-medium (CRC CM) that induce muscle atrophy. Briefly, C2C12 myotubes were treated with human cancer cell-derived CM, previously fractionated through Size-Exclusion Chromatography (SEC). After fiber staining, random fluorescent pictures were acquired in each well, using a motorized stage on a confocal microscope. Images were processed through a macro created on Fiji to automate the diameter analysis. C2C12 myotubes treated with molecules reported to promote atrophy (e.g. Dexamethasone, Activin A) or hypertrophy (e.g. IGF1, BMP2) have been analyzed and showed no statistically significant differences between manual and automated measurements in all the conditions assessed. The newly validated method has allowed to rank 31 different types of condition media from human intestinal cancer cells according to their pro-atrophic activity. Among these, five cell lines (V481, HT55, COLO 94H, COGA2, DIFI) induced remarkable myotube diameter reduction, thus suggesting the presence of released muscle-wasting molecules. HT55 cell-conditioned medium fractionation through SEC has enabled size range identification (in the order of 10.000 kDa) of the involved molecules, narrowing the spectrum to high-MW protein complexes. This automated workflow was proved to be a reliable tool for the discovery of pro-atrophic factors in high-throughput applications. Moreover, the screening performed on HT55-CM paved the way for the detection of protein aggregates responsible for muscle wasting in the tumor secretome.

La cachessia tumorale è nota per influire significativamente sulla qualità della vita dei pazienti. In vitro, la valutazione della perdita muscolare si basa principalmente sulla misurazione del diametro delle cellule muscolari C2C12. Tuttavia, tale tecnica presenta diverse limitazioni (ad esempio, è dispendiosa in termini di tempo, altamente soggettiva, ecc.). Per questo motivo, abbiamo sviluppato e validato una procedura innovativa per standardizzare e automatizzare la misurazione dei diametri dei miotubi, al fine di identificare i fattori secreti dalle cellule tumorali umane, in particolare di cancro del colon-retto, nel mezzo condizionato, capaci di indurre atrofia muscolare. In breve, i miotubi C2C12 sono stati trattati con mezzo condizionato derivato da cellule tumorali umane, precedentemente frazionato tramite cromatografia a esclusione dimensionale (SEC). Dopo aver effettuato l’immunofluorescenza sulle fibre, sono state acquisite, in modo randomico, immagini in ogni pozzetto, utilizzando un microscopio confocale attraverso uno stage motorizzato. Le immagini sono state elaborate tramite una macro creata su Fiji per automatizzare l'analisi del diametro. I miotubi C2C12 trattati con molecole note per promuovere l'atrofia (ad esempio Desametasone, Activin A) o l'ipertrofia (ad esempio IGF1, BMP2) sono stati analizzati e non hanno mostrato differenze statisticamente significative tra le misurazioni manuali e quelle automatizzate in tutte le condizioni valutate. Il metodo validato ha permesso di classificare 31 tipi diversi di mezzi condizionati da cellule tumorali intestinali umane in base alla loro attività pro-atrofica. Tra questi, cinque linee cellulari (V481, HT55, COLO 94H, COGA2, DIFI) hanno indotto una riduzione notevole del diametro dei miotubi, suggerendo la presenza di molecole rilasciate capaci di causare atrofia muscolare. Il frazionamento tramite SEC del mezzo condizionato della linea cellulare HT55 ha consentito l'identificazione del range dimensionale (dell'ordine di 10.000 kDa) delle molecole coinvolte, restringendo lo spettro a complessi proteici ad alto peso molecolare. Questa strategia automatizzata si è rivelata uno strumento affidabile per la scoperta di fattori pro-atrofici in applicazioni high-throughput. Inoltre, lo screening effettuato sul mezzo condizionato HT55 ha permesso di restringere l’analisi su aggregati proteici di grandi dimensioni presenti nel secretoma tumorale, responsabili della perdita muscolare. ​