Il danno renale nei pazienti con fisiopatologia da Fontan

ABSTRACT INTRODUCTION Fontan surgery is the last surgical step of a staged protocol for patients with single ventricle (VU). This procedure has only a palliative value, infact the new circulatory setup produces a series of poorly tolerated hemodynamic effects that, over time, result in a multi-organ deterioration whose characteristics are still largely unclear. This damage, already widely investigated at a cardiac, pulmonary and hepatic level, is instead still poorly known at renal level, where it is however conceivable that alterations with similar characteristics and mechanisms occur and where the common markers of function do not give any indication. OBJECTIVES In our study, we aimed to investigate renal damage using urinary microvesicles (uEV) from patients undergoing Fontan surgery, to assess whether they could represent a valid biomarker of damage, especially at an early stage. We focused on the expression of some renal markers of inflammation (CD3, CD56, HLA-DR) and stemness (CD133, CD24, SSEA4). In addition, we investigated a recently discovered protein (Klotho) of almost exclusively renal production and with antifibrotic, regenerative, and protective properties on several target tissues. MATERIALS AND METHODS Thirty-two patients who had already completed palliative surgery were enrolled. Urine samples were collected from which uEVs were isolated and their characterization was performed by NanoSight, super-resolution microscopy and cytofluorimetric analysis with MACSPlex exosome kit. Klotho expression was assessed by ELISA. The collected data were then compared with samples from healthy patients and a wide range of variables related to the perioperative and FU of patients with VU. RESULTS No significant differences emerged between the FUs of patients and those of healthy controls in terms of size, number, expression of tetraspanins (CD9, CD63, CD81), and renal tubular markers. Cytofluorimetric analysis showed increased inflammatory markers, decreased stemness markers, and EPCAM in patients compared with controls. Although no strong correlations emerged between perioperative/FU and uEV variables, trends could be observed. Inflammatory status seems to decrease and, at the same time, stemness status increases when the following are present: lower age at surgery, lower duct pressure, lower quantity or reduced duration of drains in the postoperative period, lower hepatic stiffness or its decreasing trend in the FU, shorter time since Fontan, higher saturation and non-packaging of fenestration. Finally, it is interesting to note that Klotho values plummet dramatically in the immediate postoperative period, resulting almost undetectable. CONCLUSIONS The analysis of uEV, in patients with palliated VU, seems to demonstrate that degenerative and evolutionary processes also occur at the renal level, in a similar way to what happens in other organs. The uEVs would seem to be excellent biomarkers for monitoring renal damage, given their functions in the body and the ease of collection. Klotho, besides being a good marker, would seem to provide an important additional information: being considered an anti-aging factor, a reduction in its levels could explain, not only the progression of kidney damage, but also the evolution of multi-organ alterations characteristic of patients undergoing Fontan surgery and which have aspects similar to those of premature aging.

ABSTRACT INTRODUZIONE L’intervento di Fontan è l’ultimo step chirurgico di un protocollo a stadi previsto per pazienti con ventricolo unico (VU). Questa procedura ha solamente una valenza palliativa, infatti il nuovo assetto circolatorio produce una serie di effetti emodinamici mal tollerati che, nel tempo, esitano in un deterioramento multiorgano le cui caratteristiche sono ancora in gran parte poco chiare. Questo danno, già ampiamente indagato a livello cardiaco, polmonare ed epatico, è invece ancora poco noto a livello renale, dove è però ipotizzabile che si verifichino alterazioni con caratteristiche e meccanismi simili e dove i comuni marcatori di funzionalità non danno alcuna indicazione. OBIETTIVI Nel nostro studio ci siamo proposti di indagare il danno renale utilizzando le microvescicole urinarie (uEV) dei pazienti sottoposti a intervento di Fontan, per valutare se potessero rappresentare un valido biomarcatore di danno, soprattutto in fase precoce. Ci siamo concentrati sull’espressione di alcuni marker renali di infiammazione (CD3, CD56, HLA-DR) e di staminalità (CD133, CD24, SSEA4). Inoltre, abbiamo indagato una proteina di recente scoperta (Klotho) di produzione quasi esclusivamente renale e con proprietà antifibrotiche, rigenerative e protettive su diversi tessuti bersaglio. MATERIALI E METODI Sono stati arruolati 32 pazienti, aventi già completato l’iter chirurgico palliativo. Sono stati raccolti campioni di urine da cui sono state isolate le uEV e la loro caratterizzazione è stata effettuata mediante NanoSight, microscopia a super risoluzione e analisi citofluorimetrica con kit MACSPlex exosome. L’espressione di Klotho è stata valutata con ELISA. I dati raccolti sono poi stati confrontati con campioni di pazienti sani e con un’ampia serie di variabili riferite al perioperatorio e all’FU dei pazienti con VU. RISULTATI Non sono emerse differenze significative tra le uEV dei pazienti e quelle dei controlli sani in termini di dimensioni, numero, espressione delle tetraspanine (CD9, CD63, CD81) e dei marcatori tubulari renali. L’analisi citofluorimetrica ha mostrato un aumento dei marcatori infiammatori, una riduzione di quelli di staminalità e di EPCAM nei pazienti rispetto ai controlli. Anche se non sono emerse forti correlazioni tra le variabili perioperatorie/al FU e le uEV, è stato possibile osservare dei trend. Sembra ridursi lo stato infiammatorio e, contemporaneamente, aumentare quello di staminalità quando sono presenti: minore età all’intervento, pressione nel condotto più bassa, minore quantità o ridotta durata dei drenaggi nel postoperatorio, minore stiffness epatica o suo trend in diminuzione nel FU, minor tempo trascorso dalla Fontan, maggiore saturazione e non confezionamento della fenestrazione. Infine, è interessante notare come i valori di Klotho precipitino drammaticamente nell’immediato postoperatorio risultando quasi indosabili. CONCLUSIONI L’analisi delle uEV, nei pazienti con VU palliati, sembra dimostrare come anche a livello renale si verifichino dei processi degenerativi ed evolutivi, in modo simile a quanto accade in altri organi. Le uEV sembrerebbero essere ottimi biomarcatori per il monitoraggio del danno renale, considerate le loro funzioni nell’organismo e la facilità di raccolta. Klotho oltre che un buon marcatore sembrerebbe fornire un’importante informazione aggiuntiva: essendo considerato un fattore anti-aging una riduzione nei suoi livelli potrebbe spiegare, non solo la progressione del danno renale, ma anche l’evoluzione delle alterazioni multiorgano caratteristiche dei pazienti sottoposti a intervento di Fontan e che hanno aspetti simili a quelli di un invecchiamento precoce.