Eggplant (Solanum melongena L.) is the world's third most cultivated species in the Solanaceae family. Eggplant cultivars have different phenotypic characteristics, particularly in the coloration of the fruit, which varies from white to purple, the latter indicating an accumulation of anthocyanins. In this thesis, we wanted to further study anthocyanin synthesis from both transcriptomic and genomic perspectives, using the dark purple-skinned eggplant cultivar Black Beauty (BB) and one of its natural mutants, named Green Beauty (GB), which has green peel but retains anthocyanin production in the flower corollas. We analyzed the transcriptomic profiles of BB and GB flowers in order to elucidate the mechanisms that regulate anthocyanin production and accumulation in flowers. RNA-seq analysis at two different stages of flower development (still green corolla and purple corolla) identified differentially expressed genes (DEGs), with up-regulation in the purple stage of both cultivars of several structural genes belonging to the anthocyanin pathway (4CL, CHS, CHI, F3H, F3'5'M, ANT17, UGT, GT, BEAT, MATE, GSTF and CYP) and transcriptional factors involved in the activation and regulation of the same pathway (HY5, ANL2, MYC1, AN2, MYB75, MYB1 and MYB102). Increases in transcription were also observed in the green stage of the flower for a gene annotated as structural (CHI.1) and for some transcription factors (bHLH62, MYBL1), which might be involved as 'repressors' of the pathway, a hypothesis also supported by their negative correlation with up-regulated structural genes in the purple stage. In addition, an in silico analysis was carried out to identify long noncoding RNAs (lncRNAs), a class of noncoding RNAs that have a molecular regulatory function in several biological processes in plants as well. A total of 2,423 potential lncRNAs were identified, of which 207 were differentially expressed (DE-lncRNAs) between the two cultivars or between the two stages of floral development. Of interest is the DE-lncRNA named MSTRG.7533.7, which has a negative Spearman correlation with structural genes and transcriptional factors with positive regulatory roles. Genomically, sequencing of DNA extracted from leaves of a BC1 population was done, which allowed gene mapping by Bulk Segregant Analysis (BSA) of SNPs, identifying chromosomal regions with significant peaks for anthocyanin production on different chromosomes (4, 7, 10 and 11). A subsequent SNP annotation analysis revealed the peak on chromosome 11 as the one containing the genes with the most point mutations. In addition, a phylogenetic analysis of MYB transcription factors, derived from different Solanaceae species, was performed with the aim of further investigating the evolutionary relationship of these important genes for the regulation of the anthocyanin pathway. In conclusion, this study made it possible to identify new genes (bHLH62, CHI.1), whose role as possible regulators in the anthocyanin pathway will be to be functionally characterized, and to explore lncRNA binding sites in the eggplant genome. Future in silico studies, combined with in vivo silencing or overexpression experiments of target genes, will therefore be crucial to elucidate the specific role that these elements play in the regulation of the anthocyanin pathway and consequently in the emergence of the GB mutant from the BB plant.
La melanzana (Solanum melongena L.) è la terza specie più coltivata al mondo nella famiglia delle Solanacee. Le cultivar di melanzana presentano caratteristiche fenotipiche diverse, in particolare nella colorazione del frutto che varia dal bianco al viola, quest’utlima indica un accumulo di antociani. In questa tesi, abbiamo voluto approfondire lo studio sulla sintesi degli antociani sia da un punto di vista trascrittomico che genomico, utilizzando la cultivar di melanzana Black Beauty (BB), dalla buccia viola scuro, e un suo mutante naturale, denominato Green Beauty (GB), dalle bacche di colore verde, ma che mantiene la produzione di antociani nelle corolle dei fiori. Abbiamo analizzato i profili trascrittomici dei fiori di BB e GB allo scopo di elucidare i meccanismi che regolano la produzione e l’accumulo di antociani nei fiori. L’analisi RNA-seq in due diversi stadi di sviluppo fiorale (corolla ancora verde e corolla viola) ha permesso di identificare i geni differenzialmente espressi (DEGs), con l’up-regolazione nello stadio viola di entrambe le cultivar di diversi geni strutturali appartenenti al pathway degli antociani (4CL, CHS, CHI, F3H, F3’5’M, ANT17, UGT, GT, BEAT, MATE, GSTF e CYP) e di fattori trascrizionali coinvolti nell’attivazione e nella regolazione dello stesso pathway (HY5, ANL2, MYC1, AN2, MYB75, MYB1 e MYB102). Sono stati osservati incrementi di trascrizione anche nello stadio verde del fiore per un gene annotato come strutturale (CHI.1) e per alcuni fattori di trascrizione (bHLH62, MYBL1), che potrebbero essere coinvolti come ‘repressori’ del pathway, ipotesi supportata anche da una loro correlazione negativa con i geni strutturali up-regolati nello stadio viola. Inoltre, è stata effettuata un’analisi in silico per identificare i long noncoding RNA (lncRNA), una classe di non coding RNA che presentano una funzione di regolazione molecolare di diversi processi biologici anche nelle piante. Sono stati individuati 2.423 potenziali lncRNA, di cui 207 differenzialmente espressi (DE-lncRNA) tra le due cultivar o tra i due stadi di sviluppo fiorale. Interessante è il DE-lncRNA denominato MSTRG.7533.7, il quale presenta una correlazione di Spearman negativa con i geni strutturali e i fattori trascrizionali con ruolo regolatorio positivo. Dal punto di vista genomico, è stato fatto un sequenziamento del DNA estratto da foglie di una popolazione BC1, che ha permesso di effettuare un gene mapping tramite Bulk Segregant Analysis (BSA) di SNP, identificando regioni cromosomiche con picchi significativi per la produzione di antociani su diversi cromosomi (4, 7, 10 e 11). Una successiva analisi di annotazione degli SNP ha evidenziato il picco del cromosoma 11 come quello contenente i geni con maggiori mutazioni puntiformi. Inoltre, è stata effettuata un’analisi filogenetica dei fattori di trascrizione MYB, derivanti da differenti specie di Solanacee, con lo scopo di approfondire il rapporto evolutivo di questi importanti geni per la regolazione del pathway degli antociani. In conclusione, questo studio ha permesso di identificare nuovi geni (bHLH62, CHI.1), il cui ruolo come possibili regolatori nel pathway degli antociani sarà da caratterizzare dal punto di vista funzionale, e di esplorare i siti di legame dei lncRNA nel genoma della melanzana. Futuri studi in silico, combinati con esperimenti di silenziamento o sovraespressione in vivo di geni target, risulteranno quindi cruciali per chiarire il ruolo specifico che questi elementi hanno nella regolazione del pathway degli antociani e di conseguenza nell’insorgenza del mutante GB dalla pianta BB.
Studio dei meccanismi di regolazione della via degli antociani in melanzana: un'analisi di genomica e trascrittomica integrata
FUDA, ANITA
2023/2024
Abstract
La melanzana (Solanum melongena L.) è la terza specie più coltivata al mondo nella famiglia delle Solanacee. Le cultivar di melanzana presentano caratteristiche fenotipiche diverse, in particolare nella colorazione del frutto che varia dal bianco al viola, quest’utlima indica un accumulo di antociani. In questa tesi, abbiamo voluto approfondire lo studio sulla sintesi degli antociani sia da un punto di vista trascrittomico che genomico, utilizzando la cultivar di melanzana Black Beauty (BB), dalla buccia viola scuro, e un suo mutante naturale, denominato Green Beauty (GB), dalle bacche di colore verde, ma che mantiene la produzione di antociani nelle corolle dei fiori. Abbiamo analizzato i profili trascrittomici dei fiori di BB e GB allo scopo di elucidare i meccanismi che regolano la produzione e l’accumulo di antociani nei fiori. L’analisi RNA-seq in due diversi stadi di sviluppo fiorale (corolla ancora verde e corolla viola) ha permesso di identificare i geni differenzialmente espressi (DEGs), con l’up-regolazione nello stadio viola di entrambe le cultivar di diversi geni strutturali appartenenti al pathway degli antociani (4CL, CHS, CHI, F3H, F3’5’M, ANT17, UGT, GT, BEAT, MATE, GSTF e CYP) e di fattori trascrizionali coinvolti nell’attivazione e nella regolazione dello stesso pathway (HY5, ANL2, MYC1, AN2, MYB75, MYB1 e MYB102). Sono stati osservati incrementi di trascrizione anche nello stadio verde del fiore per un gene annotato come strutturale (CHI.1) e per alcuni fattori di trascrizione (bHLH62, MYBL1), che potrebbero essere coinvolti come ‘repressori’ del pathway, ipotesi supportata anche da una loro correlazione negativa con i geni strutturali up-regolati nello stadio viola. Inoltre, è stata effettuata un’analisi in silico per identificare i long noncoding RNA (lncRNA), una classe di non coding RNA che presentano una funzione di regolazione molecolare di diversi processi biologici anche nelle piante. Sono stati individuati 2.423 potenziali lncRNA, di cui 207 differenzialmente espressi (DE-lncRNA) tra le due cultivar o tra i due stadi di sviluppo fiorale. Interessante è il DE-lncRNA denominato MSTRG.7533.7, il quale presenta una correlazione di Spearman negativa con i geni strutturali e i fattori trascrizionali con ruolo regolatorio positivo. Dal punto di vista genomico, è stato fatto un sequenziamento del DNA estratto da foglie di una popolazione BC1, che ha permesso di effettuare un gene mapping tramite Bulk Segregant Analysis (BSA) di SNP, identificando regioni cromosomiche con picchi significativi per la produzione di antociani su diversi cromosomi (4, 7, 10 e 11). Una successiva analisi di annotazione degli SNP ha evidenziato il picco del cromosoma 11 come quello contenente i geni con maggiori mutazioni puntiformi. Inoltre, è stata effettuata un’analisi filogenetica dei fattori di trascrizione MYB, derivanti da differenti specie di Solanacee, con lo scopo di approfondire il rapporto evolutivo di questi importanti geni per la regolazione del pathway degli antociani. In conclusione, questo studio ha permesso di identificare nuovi geni (bHLH62, CHI.1), il cui ruolo come possibili regolatori nel pathway degli antociani sarà da caratterizzare dal punto di vista funzionale, e di esplorare i siti di legame dei lncRNA nel genoma della melanzana. Futuri studi in silico, combinati con esperimenti di silenziamento o sovraespressione in vivo di geni target, risulteranno quindi cruciali per chiarire il ruolo specifico che questi elementi hanno nella regolazione del pathway degli antociani e di conseguenza nell’insorgenza del mutante GB dalla pianta BB.| File | Dimensione | Formato | |
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