Effetto del metodo di preparazione del campione nella valutazione della tossicità di polveri nanometriche tramite test in vitro

In recent years, an exponential growth in the production and the use of nanomaterials (NMs) has been observed.With the spread of NMs, concerns about their potential dangers to humans and the environment raised too.For this reason, the need to develop standardized protocols (Standard Operating Procedures-SOPs) for the evaluation of the toxicity of NMs has increased, in order to make the results obtained from different laboratories comparable and repeatable.In vitro tests are a very important tool in determining the toxicity of NMs.They measure the damage or the cellular response induced by certain doses of nanoparticles.Although the replication the complex interactions occurring at the cellular level, within an organ and between organs is difficult to be achieved, in vitro tests are an effective alternative to the toxicological characterization of NMs without the use of laboratory animals.NMs tend to agglomerate in suspension, a process that depends on the type of material, the dispersant medium and the protocol used for dispersion.There are now many experimental data indicating that the degree of agglomeration plays an important role in the internalization of NMs in cells.For this reason, it is essential to identify standardized protocols allowing to have a constant dispersion degree.For some NMs the presence of proteins, such as albumin, improves dispersion and stability over time.Proteins, in fact, adsorb at the surface of the particles and act as surfactant.However, it should be considered that the presence of proteins could lead to changes in surface properties of NMs and modification of the cellular response.Within the European FP7 NanoReg project, which included several activities aimed to develop a regulation for NMs, a standardized dispersion protocol was proposed for the suspension of these NMs in the presence of bovine serum albumin.In the present study, we have evaluated whether the results obtained with the standardized protocol were different from those obtained through a classical protocol, which consists of their suspension in water.Several nano-powders of titanium dioxide, amorphous silica and cerium dioxide, derived from the Joint Research Center Repository in Ispra, were examined and two different cell lines were used: the THP-1 line and the RAW line 264.7.They was chosen because the most common exposure to powders route is inhalation.In fact, macrophages represent the first immune defense of the respiratory tract.Cytotoxicity (release of lactate dehydrogenase) and the oxidative stress induction capacity (nitrite production) have been evaluated.The suspensions in medium were also analyzed using Dynamic Light Scattering and Electrophoretic Light Scattering techniques to measure the hydrodynamic diameter of the powders and the ζ potential.The results obtained showed a substantial absence of toxicity of titanium dioxide and cerium powders.In contrast, dose-dependent toxicity was observed on both cell lines of one of the silica samples, regardless of the type of dispersion protocol used.Differences were observed on a second silica sample, similar in properties to the previous one, which causes toxicity to murine macrophages with the only standardized protocol.The results obtained show how the dispersion protocol is important, although only for some materials, confirming the need for standardized protocols, since this effect is unpredictable based on the chemical-physical properties of the material

Negli ultimi anni la produzione e l'uso dei nanomateriali (NMs) ha subito una crescita esponenziale. Con la loro diffusione sono aumentate anche le preoccupazioni sulla loro potenziale pericolosità sull'uomo e sull'ambiente.Perciò è cresciuta l'esigenza di sviluppare protocolli standardizzati (Standard Operating Procedure-SOPs) per la valutazione della tossicità dei NMs al fine di rendere i risultati di laboratori diversi confrontabili e ripetibili.I test in vitro sono uno strumento importante nella determinazione della loro tossicità.In essi si misura il danno o la risposta cellulare causato da determinate dosi di nanoparticelle.Sebbene sia difficile replicare le complesse interazioni che si verificano a livello cellulare, all'interno di un organo e tra organi, i test in vitro si presentano come una valida alternativa per la caratterizzazione tossicologica dei NMs senza il ricorso di animali da laboratorio.I NMs tendono ad agglomerare in sospensione in base al tipo di materiale, al mezzo disperdente e al protocollo utilizzato per la dispersione.Esistono ormai molti dati sperimentali che indicano come il grado di agglomerazione sia importante nell'internalizzazione dei NMs nelle cellule.Perciò è fondamentale individuare protocolli standardizzati che permettano di avere un grado di dispersione costante.Per alcuni NMs la presenza di proteine, come l'albumina, migliora la dispersione e la stabilità nel tempo adsorbendosi alla superficie delle particelle e agendo come surfattante.Bisogna però considerare che la presenza di proteine può causare cambiamenti nelle proprietà di superficie dei NMs e modificare la risposta cellulare.All'interno del progetto europeo FP7 NanoReg, che prevedeva diverse attività finalizzate allo sviluppo di una regolamentazione per i NMs, è stato proposto un protocollo di dispersione standardizzato che prevede la loro sospensione in presenza di albumina serica bovina.In questo studio si è valutato se i risultati ottenuti con il protocollo standardizzato fossero diversi rispetto a quelli ottenuti attraverso un protocollo classico (con sospensione in acqua).Sono state prese in esame alcune polveri nanometriche di titania, silice amorfa e ceria derivanti dal Repository del Joint Research Center di Ispra e sono state utilizzate due differenti linee cellulari: la linea THP-1 e la linea RAW 264.7.Esse sono state scelte poichè la via di esposizione più comune alle polveri è quella inalatoria ed i macrofagi, infatti, ne costituiscono la prima difesa immunitaria. Sono state valutate la citotossicità e la capacità di induzione dello stress ossidativo.Le sospensioni in terreno sono state analizzate con le tecniche Dynamic Light Scattering e Electrophoretic Light Scattering per misurare il diametro idrodinamico delle polveri e il potenziale ζ. I risultati ottenuti hanno evidenziato una sostanziale assenza di tossicità delle polveri di titania e di ceria.Si è osservata una tossicità dose-dipendente su entrambe le linee cellulari di uno dei campioni di silice, con entrambi i protocolli di dispersione.Si notano differenze su un secondo campione di silice, molto simile al precedente, che induce una tossicità verso i macrofagi murini con il solo protocollo standardizzato.I risultati ottenuti evidenziano come il protocollo di dispersione sia importante, sebbene solo su alcuni materiali,confermando la necessità di protocolli standardizzati, essendo tale effetto poco prevedibile sulla base delle proprietà chimico-fisiche del materiale