Analysis in progress: evoluzione dei sistemi identificativi dei microrganismi

Aim of this thesis is to highlight the evolution that have undergone laboratory techniques for microbial identification: from biochemical to biomolecular methods. The basic techniques used for the identification of microorganisms (MO) consist in stimulating the growth of the bacteria taking advantage of its metabolic capacity, expressed on selective agar media, which allow, through the recognition of specific morphologies, to hypothesize the presence of the targeted species. In many cultivation methods are also observed metabolic activities typical of the targeted MO, which are detectable through color changes of media/colony or with lysis halos or clarification of the agar around the colony. After detection of typical colonies, other biochemical tests (such as the catalase and oxidase tests) are performed to allow a better characterization of the metabolic behavior, while not leading to a final identification. This latter may be performed through specific biochemical tests, which allow to obtain an identification based on the metabolized products, highlighted by the color change of the substrates in which the MO grows. Among these biochemical test, the Enterotube (for Enterobacteriaceae), and API's galleries. These methods to date are used contextually, if not completely replaced, with biomolecular techniques, since this latter allow to obtain the identification more timely, decreasing the costs, and with a very high degree of likelihood. Among these, the Polymerase Chain Reaction (PCR), which allows the in vitro amplification of DNA also when few isolated cells are available in the analyzed specimen. A further development of PCR has made it possible to use probes and species-specific primers, directly on the food matrix, avoiding the culturing. Since the invention of PCR, several PCR-based methods have been developed in the following years: Quantitative PCR (qPCR or Real Time PCR), which allows to identify and quantify the MO directly in the food, and Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR), that allows to obtain by reverse transcription of mRNA, copies of DNA, thus differentiating viable from non-viable MO, essential in processed foods. Among the techniques that do not require the growth of MO in laboratory conditions, it should be mentioned also the Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) now applied on many matrices. In recent years, new protocols for DNA extraction from food, for a subsequent sequencing have been developed, the so-called metagenomics: NGS (Next-Generation Sequencing). This type of sequencing allows to identify simultaneously millions of fragments from different DNAs, thus causing a significant reduction in analysis time and allowing the identification, in a single amplification, all microbial DNA present within the analyzed matrix. In conclusion, the advancement of knowledge in the field of biomolecular methods has led to obtain information on the presence/absence or quantification of specific MO and to identify the microbial species present in a given food, without necessarily focusing on the search for some species in particular, offering the concrete possibility to study the real microbial ecology in foods, without need of culturing, reducing time and selection effect due to cultivation methods. However, the latest generation methods (NGS) are still expensive and difficult to apply on a large scale, but necessary today as a useful and fundamental means of food research.

Scopo del lavoro è mettere in evidenza l'evoluzione che hanno subito le metodiche di laboratorio, da quelle biochimiche ai metodi biomolecolari. Le tecniche base utilizzate per l'identificazione dei microrganismi (MO) consistono nello stimolare la crescita del batterio sfruttando le sue capacità metaboliche, espresse su terreni agarizzati selettivi, che permettono, mediante il riconoscimento di morfologie specifiche, di ipotizzare la presenza di una specie. Con esse si osserva inoltre anche l'attività metabolica del MO che è evidenziabile con alterazioni di colore del mezzo, della colonia o con evidenti aloni di lisi o chiarificazione dell'agar. Al sospetto su terreno si affiancano anche altri esami biochimici come il test della catalasi e quello dell'ossidasi, che però non portano ad una identificazione definitiva. Questa può essere eseguita mediante test biochimici specifici, che consentono di ottenere un'identificazione in base ai prodotti metabolizzati, evidenziati dal viraggio del colore dei substrati in cui si sviluppa il MO. Tra questi test sono oggi ancora utilizzati gli Enterotube (per Enterobacteriaceae) e le gallerie API, disponibili in diverse varianti per la differenziazione di specie appartenenti agli stessi generi o famiglie. Queste metodiche ad oggi sono sempre affiancate, se non sostituite del tutto, dalle tecniche biomolecolari, in quanto consentono di ottenere il nome della specie in tempi brevi, a costi ridotti e con un altissimo grado di accuratezza. La Polymerase Chain Reaction (PCR) consente l'amplificazione in vitro del DNA anche avendo a disposizione poche cellule isolate in piastra. Un ulteriore sviluppo ha consentito l'identificazione tramite l'utilizzo di sonde e primer specie-specifici, direttamente sulla matrice alimentare, evitando la coltura. Dall'invenzione di tale tecnica, sono diverse le metodiche PCR-based, tra cui è indispensabile annoverare la Quantitative PCR (qPCR o Real Time PCR), che consente di identificare e quantificare il MO in esame direttamente nell'alimento, e la Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR), che a differenza delle precedenti consente tramite retrotrascrizione di ottenere copie dell'mRNA, andando così a differenziare i MO vitali da quelli non vitali, indispensabile in alimenti trattati termicamente. Tra le tecniche colture-independent va citata anche la Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) oramai applicata su molte matrici. Negli ultimi anni si sono sviluppati nuovi protocolli di estrazione del DNA dall'alimento per un successivo sequenziamento, la cosiddetta metagenomica: NGS (Next-Generation Sequencing). Questo metodo consente di identificare contemporaneamente milioni di frammenti provenienti da diversi DNA, determinando così una riduzione importante dei tempi di analisi e permettendo di identificare in una sola amplificazione tutti i DNA microbici presenti all'interno della matrice analizzata. In conclusione, l'avanzamento delle conoscenze in campo biomolecolare ha permesso di poter ottenere informazioni sulla presenza/assenza e quantificazione di MO e di identificare le specie microbiche senza focalizzarsi su alcune in particolare, offrendo la possibilità concreta di studiare la reale ecologia microbica in alimenti, riducendo i tempi, la selezione e le interferenze delle metodiche colturali. Tuttavia, le metodiche di ultima generazione sono ancora costose e difficilmente applicabili su larga scala, anche se ad oggi sono un utile e fondamentale mezzo di ricerca.