Can we store hydrophobic compounds in lipid bodies? Metabolic engineering of Nicotiana benthamiana leaves for sesquiterpene accumulation

L'obiettivo di questa tesi è stata la messa a punto di modi alternativi per lo stoccaggio in vivo di molecole volatili, e, nello specifico, del sesquiterpene α-bisabololo usato in cosmesi, per ridurre l'impiego delle attuali fonti problematiche (l'olio blu ottenuto dalla distillazione della camomilla, il prodotto di sintesi ad attività ridotta, lo sfruttamento delle piante di Candeia). La strategia adottata si basa sulla produzione de novo in Nicotiana benthamiana di lipid bodies, organelli utilizzati per l'accumulo di triacilgliceroli (TAG), lipidi neutri ad alta energia impiegati in diversi settori. A questo scopo sono stati coespressi in modo transiente tre geni di importanza cruciale (i) nella biosintesi degli acidi grassi (fattore trascrizionale WRINKLED1; WRI1), (ii) nell'assemblaggio dei TAG (diacilglicerol aciltransferasi di tipo 1; DGAT1) e (iii) nella biogenesi dei lipid bodies (proteina di rivestimento OLEOSIN1), modificando ad hoc il sistema di 'Push-Pull-Protect' descritto da Vanhercke et al. (Plant Biotechnology Journal, 2014). Questi geni sono stati isolati sia da A. thaliana (At), come precedentemente descritto in altri lavori, che da Ricinus communis (Rc), specie in grado di produrre grandi quantità di olio nei semi e novità per questo tipo di approccio. La loro azione è stata studiata attraverso agroinfiltrazione: l'effetto sinergico di A. thaliana WRI1 e DGAT1 descritto in precedenza è stato confermato; la produzione dei lipid bodies e la loro presenza all'interno delle cellule del mesofillo è stata dimostrata grazie alla colorazione con Sudan IV, specifica per i lipidi neutri; WRINKLED1 di R. communis (RcWRI1) si è rivelato essere più adatto del gene di Arabidopsis (AtWRI1); DGAT1 di R. communis (RcDGAT1) è risultato meno efficace a causa della sua selettività di substrato, per cui si è preferito quello di Arabidopsis (AtDGAT1). Infine si è potuta incrementare la stabilità dei lipid bodies grazie all'utilizzo di OLEOSIN1 di R. communis (RcO1). Il momento più adatto al campionamento è stato fissato a 7 giorni post infiltrazione, e la combinazione di geni più efficiente (RcWRI1+AtDGAT1+RcO1) è stata determinata attraverso gravimetria ed analisi TLC ottimizzata per la quantificazione dei lipidi neutri. La coespressione dei tre geni ha portato ad un incremento del contenuto lipidico totale di 3 volte, fino al 6.7% del peso secco fogliare, di cui circa il 15.5% è risultato essere costituito da TAG. Ispirandosi alle strutture naturalmente adibite all'accumulo di terpeni nei vegetali (es. tricomi e ghiandole secretrici), si è tentato di compartimentare il bisabololo prodotto all'interno dei lipid bodies; la (+)-α-bisabololo sintasi di Artemisia annua (AaBOS) è stata quindi coespressa insieme al macchinario per la produzione di lipid bodies. Il contenuto di bisabololo rilevato negli estratti fogliari (142 µg/g di tessuto) ha denotato un incremento dell'accumulo del composto volatile di 3.5 volte. Si è quindi potuta dimostrare un'alta correlazione tra l'incremento in TAG, sotto forma di organelli di natura idrofobica, e l'incremento dei sesquiterpeni accumulati. Questo aspetto si è potuto ancor più evidenziare grazie all'uso della doppia colorazione: tramite un colorante specifico per i lipidi neutri ed uno per i terpeni è stato possibile dimostrare l'effettiva presenza di bisabololo accumulato all'interno dei lipid bodies, offrendo dunque un sistema di stoccaggio potenzialmente utilizzabile per composti della stessa natura.

The main goal of this thesis was to demonstrate novel alternative ways for the storage in vivo of volatile molecules, and, more specifically, of the sesquiterpene used in cosmetics α-bisabolol, in order to reduce the use of the current problematic sources (the oil obtained from chamomile distillation is blue, the synthetic product has reduced activity, Candeia trees are exploited and in danger of extinction). The strategy adopted is based on the de novo production in Nicotiana benthamiana of lipid bodies, organelles used for triacylglycerol (TAG) accumulation, energy-dense neutral lipids employed for several different applications. To do so, the combined transient expression of three genes that play critical roles in (i) fatty acid biosynthesis (WRINKLED1 transcription factor; WRI1), (ii) TAG assembly (DGAT1 diacylglycerol acyltransferase type 1) and (iii) lipid droplet biogenesis (OLEOSIN1 coating protein) was performed, customizing the 'Push-Pull-Protect' system described by Vanhercke et al. (Plant Biotechnology Journal, 2014). These genes have been isolated from both A. thaliana (At) (already reported in previous studies) and the high oil-seed producing Ricinus communis (Rc) plant, a novelty for this approach. The action of the selected genes was investigated by means of leaf agro-infiltration: the previously described synergistic effect of A. thaliana WRI1 and DGAT1 was confirmed; Sudan IV neutral lipid-specific staining demonstrated the production of lipid body organelles and their localisation in mesophyll cells; WRINKLED1 from R. communis (RcWRI1) proved to be better suited than the Arabidopsis one (AtWRI1); R. communis DGAT1 (RcDGAT1) appeared to be less effective due to its substrate selectivity, hence Arabidopsis DGAT1 (AtDGAT1) was preferred; the use of R. communis OLEOSIN1 (RcO1) further improved lipid body stability. The most suitable sampling time was set at 7 days after infiltration, and the best gene combination (RcWRI1+AtDGAT1+RcO1) was established through gravimetric analysis and a TLC method optimized for neutral lipid quantification. This combined strategy led to a 3-fold increase in total lipid content (up to 6.7% of the leaf dry weight) and succeeded in boosting TAG production to approximately 15.5% of the total lipids. Taking inspiration from the natural terpene storage tissues in plants (e.g. trichomes and secretory glands), we tried to store the produced bisabolol inside lipid bodies. Artemisia annua (+)-α-bisabolol synthase (AaBOS) was therefore co-expressed together with the lipid body machinery, and GC-MS analysis displayed a 3.5-fold increase of the retained bisabolol, up to 142 µg per gram leaf tissue. It was thus possible to show a high correlation between the increase in TAGs, in the form of lipid body hydrophobic compartments, and the increased sesquiterpenic accumulation. Furthermore, by co-staining the transformed leaf tissue with both neutral lipid and terpene specific dyes, evidence was found that the actual location of the stored bisabolol was within the lipid bodies, paving the way for investigating the potential storage of other sesquiterpenic compounds.