Analisi strutturale del gene che codifica per il complesso ossitocina-neurofisina I (OXT) nei camelidi domestici

L'ossitocina è un ormone nonapeptide di tipo neuroipofisario, implicato in numerosi aspetti inerenti la riproduzione tra cui: il comportamento sessuale, sociale e materno, l'induzione del travaglio e l'eiezione del latte. L'oggetto del presente lavoro di tesi sperimentale è stato quello di analizzare la struttura del gene codificante per il complesso ossitocina-neurofisina I (OXT) nelle quattro specie di camelidi domestici, ovvero sia Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama e Vicugna pacos. Inoltre, è stata condotta una caratterizzazione molecolare delle regioni regolatrici al 5' e 3' del gene identificando in silico i principali siti consenso per i fattori di trascrizione putativamente responsabili dell'espressione del gene. Il DNA genomico estratto dai leucociti ottenuto da dodici campioni individuali di sangue provenienti da regioni differenti (Nigeria, Germania, Italia e Perù) è stato impiegato come templato per le reazioni di amplificazione del gene OXT. Si è proceduto a disegnare i primers necessari ad amplificare l'intero gene mediante PCR. I campioni amplificati sono stati quindi purificati dai residui di amplificazione e sequenziati in out-sourcing (MicroSynth ¿ Vienna), mediante il metodo enzimatico di Sanger. Le sequenze ottenute sono state analizzate ed assemblate grazie all'uso di software bioinformatici come Chromas 2.4 e DNASIS®MAX Ver 2.5. Il gene si sviluppa su di un tratto di DNA in media di 814bp, ed è costituito da tre esoni rispettivamente di 154, 202 e 115 nucleotidi e due introni di lunghezza variabile a seconda della specie di appartenenza con un range di 239/246 bp per l'introne 1 e 93/115 bp per l'introne 2. L'analisi della sequenza ha messo in evidenza la presenza di: - nove polimorfismi nelle regioni introniche, apparentemente non responsabili di differenze nell'espressione del gene poiché non vanno ad alterare siti canonici di splice; - nove SNP nelle regioni esoniche, cinque dei quali sono polimorfismi inter-specie e sembrano evidenziare differenze tra i camelidi del nuovo mondo da quelli del vecchio mondo. In particolare, uno SNP è responsabile di una sostituzione amminoacidica Gly60-->Ala, mentre le restanti quattro mutazioni identificate negli individui di Camelus dromedarius sono polimorfismi specie specifici ed individuano possibili varianti alleliche al locus OXT. L'analisi strutturale della regione al 5' del gene, ha messo in evidenza la presenza di differenti elementi regolatori, alcuni comuni a tutte e quattro le specie altri distintivi dei due gruppi (nuovo mondo e vecchio mondo). Il confronto delle regioni promoter delle quattro specie ha evidenziato un totale di cinquantaquattro siti polimorfici. I più interessanti sono quelli che ricadono in prossimità dei siti di regolazione, in quanto potrebbero destabilizzare il riconoscimento delle sequenze consenso per i corrispondenti fattori di trascrizione ed indurre quindi a differenze nell'espressione genica. In conclusione, i risultati ottenuti da questo lavoro hanno consentito per la prima volta il sequenziamento dell'intero gene codificante l'ossitocina-neurofisina I nei camelidi del nuovo e del vecchio mondo. L'analisi dei marcatori genetici individuati potrà essere utile in futuri programmi di selezione assistita per il miglioramento dei caratteri controllati dall'OXT, favorendo una migliore utilizzazione di questi camelidi domestici da parte delle popolazioni e dei paesi che li impiegano come fonte economica e di sostentamento.