Ruolo degli ossisteroli nella malattia di Alzheimer: modulazione della via di neuroprotezione SIRT1-dipendente

Alzheimer's disease (AD) is characterized by extracellular amyloid beta (Aβ) plaques and by intracellular neurofibrillary tangles (NFT) made of hyperphosphorylated Tau protein. The molecular mechanisms of these pathological features are still not clear, however, in the last several years, a link between alterated brain cholesterol metabolism and AD has been reported; moreover, hypercholesterolemia is considered a potential risk factor of the disease. It has also been demonstrated that cholesterol oxidation products (known as oxysterols), unlike cholesterol, can cross the blood-brain barrier (BBB). The oxysterols potentially most closely involved in the pathogenesis of AD are 24-hydroxycholesterol (24-OH) and 27-hydroxycholesterol (27-OH), respectively deriving from cholesterol oxidation by the enzymes. However, other oxysterols resulting from cholesterol autoxidation were identified in post-mortem human AD brains, including 7-ketocholesterol (7-K) and 7β-hydroxycholesterol (7β-OH) and their possible involvement in AD pathogenesis is now emerging. We have investigated, in autopsy specimens from the cerebral cortex of AD brains, the association between changes in oxysterol and sirtuin 1 (SIRT1), a deacetylase promoting neuroprotection, levels. Moreover, we have observed that SIRT1 was markedly reduced with the progression of AD, suggesting that the survival SIRT1-dependent pathway might play a key role in AD pathogenesis. Besides the ex vivo study, we have investigated in vitro, in neuroblastoma SK-N-BE cells, whether 24-OH (1 µM) and 7-K (1 µM), of enzymatic and non-enzymatic origin respectively, were able to modulate the neuroprotective SIRT1-dependent pathway. We have observed that only 24-OH induces a significant up-regulation of both SIRT1 expression and synthesis. In literature, it has been demonstrated that SIRT1-mediated deacetylation of Tau enhances Tau ubiquitination leading to Tau degradation via proteasome, especially phospho-Tau degradation. We have observed that activation of the SIRT1-dependent pathway induced by 24-OH can reduce phospho-Tau accumulation. Recent studies have demonstrated that oxidative stress, in the early phase of AD, can induce the activity of SIRT1 enzyme. We have investigated the production of ROS in the cells treated with the oxysterols. We have observed that only 24-OH, but not 7-K, induces intracellular production of ROS, supporting the hypothesis that SIRT1 activation induced by 24-OH is ROS-dependent. To confirm this observation, before the treatment with 24-OH, SK-N-BE cells were pretreated with apocynin, an inhibitor of NADPH-oxidase, or rotenone, a mitochondrial respiratory chain inhibitor, the two main ROS sources. Blocking the intracellular production of ROS, a reduction of SIRT1 levels and, consequently, an increase of fosforilated Tau levels were observed. Taking into account these data, up-regulation of the neuroprotective SIRT1-dependent pathway by 24-OH may provide a new strategic therapy to counteract neuron death and the progression of AD.

La malattia di Alzheimer (MA) è caratterizzata dalla formazione di placche amiloidi, dovute all'accumulo extraneuronale di β-amiloide, e dalla formazione intraneuronale di grovigli neurofibrillari (GNF) di proteina Tau iperfosforilata. I meccanismi molecolari alla base di queste manifestazioni patologiche non sono ancora del tutto chiari ma, in questi ultimi anni, è stata messa in evidenza l'associazione tra l'alterato metabolismo del colesterolo a livello cerebrale e la MA. E' stato inoltre dimostrato che i prodotti di ossidazione del colesterolo, denominati ossisteroli, a differenza del colesterolo, sono in grado di passare la barriera emato-encefalica (BEE). Gli ossisteroli potenzialmente coinvolti nella patogenesi della MA sono il 24-idrossicolesterolo (24-OH) e il 27-idrossicolesterolo (27-OH) che derivano dall'ossidazione del colesterolo per via enzimatica. Recentemente, comunque, altri ossisteroli derivanti dall'autossidazione del colesterolo sono stati identificati post-mortem nel cervello di pazienti affetti da MA, tra cui il 7-chetocolesterolo (7-K) ed il 7β-idrossicolesterolo (7β-OH), il cui coinvolgimento nella patogenesi della MA sta ora emergendo. L'analisi di campioni autoptici di corteccia cerebrale, ottenuti da pazienti affetti da MA, ha messo in evidenza una possibile associazione tra i livelli di alcuni ossisteroli e quelli della sirtuina 1 (SIRT1), una deacetilasi che promuove la neuroprotezione. E' inoltre emerso che i livelli di SIRT1 nei cervelli diminuiscono con il progredire della malattia, suggerendo che la via di sopravvivenza SIRT1-dipendente gioca un ruolo fondamentale nel contrastare l'insorgenza della MA. A questo studio ex vivo, è stato affiancato uno studio in vitro: abbiamo valutato, nelle cellule di neuroblastoma umano SK-N-BE, se il 24-OH (1 µM) e/o il 7-K (1 µM), rispettivamente di origine enzimatica e non, fossero in grado di modulare la via di sopravvivenza neuronale SIRT1-dipendente. Si è osservato che solo il 24-OH induce un aumento sia dell'espressione sia della sintesi di SIRT1. In letteratura, è riportato che la deacetilazione della proteina Tau mediata da SIRT1, promuove l'ubiquitinazione e conseguentemente la degradazione proteasomica della stessa Tau, soprattutto della Tau fosforilata. Abbiamo quindi osservato che l'attivazione della via SIRT1-dipendente da parte del 24-OH è in grado di ridurre l'accumulo della proteina Tau iperfosforilata. Dalla letteratura è anche noto che, nella fase precoce della malattia, lo stress ossidativo induce l'attivazione di SIRT1. Abbiamo allora valutato la produzione delle ROS nelle cellule trattate con gli ossisteroli. Anche in questo caso, solo il 24-OH, e non il 7-K, induce la produzione intracellulare delle ROS, a sostegno dell'ipotesi che l'attivazione di SIRT1 indotta dal 24-OH è ROS-dipendente. Per confermare questo dato, le cellule, prima del trattamento con il 24-OH, sono state pretrattate con apocinina o rotenone, rispettivamente inibitori della NADPH ossidasi e della catena respiratoria mitocondriale, le due principali sorgenti della produzione delle ROS. Bloccando tale produzione intracellulare si ha una riduzione dei livelli di SIRT1 e, conseguentemente, un aumento dei livelli di Tau fosforilata. Alla luce di questi dati, l'attivazione della via di neuroprotezione SIRT1-dipendente da parte dell'ossisterolo 24-OH potrebbe rivelarsi una nuova strategia terapeutica per contrastare la morte delle cellule neuronali e la progressione della MA.