Nano-immunoterapia con liposomi decorati con TRAIL e inibitori dei checkpoint immunitari come trattamento per il cancro

Cancer is a leading cause of death worldwide accounting for almost 20 million new cases and 9 million deaths per year. In the light of these numbers, the development and implementation of efficient anticancer treatments is vital. So far, thousands of anticancer treatments have been produced and tested: among them, the TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) agonists (TRAs) sparked a great interest due to their ability to induce cancer cell death while sparing normal cells. Nevertheless, TRAs presented disappointing results in clinical trials, mainly due to cancer cells resistance. For this reason, new formulations of TRAIL-based therapies have been investigated and the binding of TRAIL to large unilamellar vesicles (LUV) emerged as an extremely advantageous solution. LUV-TRAIL are artificial liposomes decorated on their surface with TRAIL molecules, that resemble the natural exosomes released by T and NK cells after their activation. These liposomes have shown a greater cytotoxic activity compared to soluble TRAIL (sTRAIL) both in vitro and in vivo. In this study, we aimed to implement this basic LUV-TRAIL formulation by including in the liposome surface the immune checkpoint inhibitor αPD-L1 single chain variable fragment (scFv), producing the final LUV-TRAIL-αPD-L1. For this purpose, the antibody fragment has been purified from Pichia pastoris yeast strain SMD1168 transformed with the pPICZalphA-Atezo-HisTag plasmid, and it has been combined with the LUV only and with LUV-TRAIL. Then, the specific binding efficacy of αPD-L1 ScFv alone and in combination with the LUV has been assessed by flow cytometry using breast and colorectal cancer cell lines, either positive or negative for PD-L1 surface expression. Finally, in vitro cytotoxicity of LUV-TRAIL-αPD-L1 in comparison with LUV-TRAIL has been evaluated. The produced αPD-L1 ScFv is able to bind with great specificity to its target, also when it is anchored to the liposome surface. Breast and colon tumors positive for DR5 and PD-L1 expression are very sensitive to LUV-TRAIL-induced cell death at low concentrations, and this cytotoxicity is barely increased when including the anti-PDL1 scFv in the liposome. Remarkably, those liposomes are not cytotoxic against primary NK cells. According to these results, the antitumor potential of LUV-TRAIL-αPD-L1 is worth to be further investigated, using CTL and NK cells as anti-tumoral effectors, and also by in vivo assays.

Il cancro è una delle principali cause di morte a livello mondiale, con quasi 20 milioni di nuovi casi e 9 milioni di decessi all'anno. Alla luce di questi numeri, lo sviluppo e l'implementazione di trattamenti antitumorali efficaci è di vitale importanza. Finora sono stati prodotti e testati migliaia di trattamenti antitumorali: tra questi, gli agonisti del "TNF-related apoptosis- inducing ligand” (TRAIL) (TRA) hanno suscitato un grande interesse per la loro capacità di indurre la morte delle cellule tumorali risparmiando le cellule normali. Tuttavia, i TRA hanno presentato risultati deludenti negli studi clinici, soprattutto a causa della resistenza delle cellule tumorali. Per questo motivo, sono state studiate nuove formulazioni di terapie basate su TRAIL e il legame di TRAIL a “large unilamellar vesicles” (LUV) è emerso come una soluzione estremamente vantaggiosa. I LUV-TRAIL sono liposomi artificiali decorati sulla loro superficie con molecole TRAIL, che assomigliano agli esosomi naturali rilasciati dalle cellule T e NK dopo la loro attivazione. Questi liposomi hanno dimostrato una maggiore attività citotossica rispetto al TRAIL solubile (sTRAIL) sia in vitro che in vivo. In questo studio, abbiamo voluto implementare questa formulazione di base di LUV-TRAIL includendo nella superficie del liposoma l'inibitore del checkpoint immunitario “αPD-L1 single chain variable fragment” (scFv), producendo il LUV-TRAIL-αPD-L1 finale. A tale scopo, il frammento anticorpale è stato purificato dal ceppo di lievito Pichia pastoris SMD1168 trasformato con il plasmide pPICZalphA-Atezo-HisTag ed è stato combinato con il solo LUV e con LUV-TRAIL. Quindi, l'efficacia del legame specifico di αPD-L1 scFv da solo e in combinazione con il LUV è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando linee cellulari di cancro al seno e al colon-retto, positive o negative per l'espressione di superficie di PD-L1. Infine, è stata valutata la citotossicità in vitro di LUV-TRAIL-αPD-L1 rispetto a LUV-TRAIL. L'αPD-L1 scFv prodotto è in grado di legarsi con grande specificità al suo bersaglio, anche quando è ancorato alla superficie del liposoma. I tumori del seno e del colon positivi per l'espressione di DR5 e PD-L1 sono molto sensibili alla morte cellulare indotta da LUV-TRAIL a basse concentrazioni, e questa citotossicità aumenta leggermente quando si include αPD-L1 scFv nel liposoma. Sorprendentemente, questi liposomi non sono citotossici contro le cellule NK primarie. In base a questi risultati, il potenziale antitumorale di LUV-TRAIL-αPD-L1 merita di essere ulteriormente studiato, utilizzando cellule CTL e NK come effettori antitumorali e anche mediante saggi in vivo.