Analisi funzionali su un residuo fosforilabile presente nella proteina chinasi C, Pkc1, nel Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has long proved to be a useful model for the study of different fundamentals aspects, concerning the eukaryotic cell biology, since it consists of many biochemical components identical to those present in higher eukaryotes, it grows rapidly in chemically defined media and because it is easy to isolate. Necessary for its survival is the cell wall integrity pathway, CWI (mediated by MAPK kinase module), and in particular one of its factors, the protein kinase C1, Pkc1, a serine-threonine kinase. A recent phosphoproteomics analysis of this protein has shown the presence of phosphopeptides hyperphosphorylated in consensus sites (SP / TP), for MAPK kinases, upon overstimulation of the route. It proved to be particularly interesting the residue S226 SP, on which the research has focused. In this context, the objectives of the thesis are: 1. Check if the residue is S226 is conserved in the different species of Saccharomyces and other generis; 2. to develop a new plasmid and study it as a possible target phosphorylation mediated by kinase Slt2 (other CWI pathway factor); 3. to carry mutant versions of S226 and compare them with the wild type under different stimuli of the pathway. 1.Using the BLAST program it was proved the preservation of S226 through the evolution, showing that this residue may play an important role in Pkc1 function; 2. by applying PCR was generated the plasmid pGEX-KGPkc1Nt, comprising the residue S226, and the following execution of a kinase assay showed that S226 is phosphorylated by Slt2 which would mean a subsequent up-regulation of Pkc1 and hyper activation of CWI pathway. 3. Employing overlapping PCR and site-directed mutagenesis two mutant versions of Pkc1 were generated, respectively, the S226A version, in which the serine of the residue was replaced by alanine, not phosphorylatable, and S226D version, where the serine was replaced by aspartate, phosphomimetic; as a template was used for both the pVD67-Pkc1-mCherry. These versions were transformed either into the mutant strain lacking in pkc1 (MML344) and in the wild-type one (CML128), and then, they were subjected to the action of chemical agents and high temperature, capable of stimulating the CWI pathway; from the results obtained it was found that cells transformed in the mutant strain cannot survive in these conditions unlike the ones transformed in the mutant strain who survive, to demonstration and conclusion to the fact that Pkc1, it is not only important to ensure the transmission of the signal in the cell signaling cascade, but is also essential for the maintaining the integrity of the cell wall, and thus for cell survival.

Il Saccharomyces cerevisiae ha da tempo dimostrato di essere un modello utile per lo studio di diversi aspetti fondamentali concernenti la biologia cellulare eucariotica, in quanto è costituito da molti componenti biochimici uguali a quelli presenti negli eucarioti superiori, cresce rapidamente in terreni chimicamente definiti ed è inoltre facile da isolare. Necessaria per la sua sopravvivenza è la via di segnalazione di integrità della parete cellulare, the cell wall integrity pathway, CWI (mediata dal modulo MAPK chinasi), ed in particolare uno dei suoi fattori, la proteina chinasi C1, Pkc1, una serina-treonina chinasi. Una recente analisi fosfoproteomica di questa proteina ha evidenziato la presenza di fosfopeptidi fosforilati in siti consenso per MAPK (SP/TP) in caso di stimolazione della via. Particolarmente interessante si è rivelato il residuo S226 SP sul quale si è concentrata la ricerca. È in questo contesto che si inseriscono gli obiettivi della tesi:1.verificare se il residuo S226 si conserva nelle diverse specie di Saccharomyces ed altri generis;2.costruire un nuovo plasmide e studiarlo come possibile target di fosforilazione mediata dalla chinasi Slt2 (altro fattore della CWI pathway); 3.realizzare le versioni mutanti di S226 e confrontarle con il wild type quando sottoposte a diverse stimolazioni. 1.Tramite il programma BLAST è stata comprovata la conservazione di S226 nell'evoluzione, dimostrando che questo residuo potrebbe svolgere un ruolo importante nella funzione di Pkc1; 2. Attraverso la PCR è stato costruito il plasmide pGEX-KGPkc1Nt, comprendente il residuo S226, e la successiva esecuzione di un saggio chinasico ha dimostrato che S226 viene fosforilato da Slt2 il che potrebbe comportare una successiva up-regulation di Pkc1 ed iper-attivazione della CWI. 3. Mediante overlapping-PCR e site-directed mutagenesis sono state generate due versioni mutanti di Pkc1, rispettivamente, la versione S226A in cui la serina è stata sostituita dall'alanina, non fosforilabile, e la versione S226D, dove la serina è stata sostituita dall'aspartato, fosfomimetico; come template per entrambi è stato adoperato il pVD67-Pkc1-mCherry. Queste versioni sono state trasformate nel ceppo mutato pkc1Δ (MML344), e in quello wild type (CLM128), dopodiché sono state sottoposte all'azione di agenti chimici ed alte temperature in grado di stimolare la via d'integrità cellulare; dai risultati ottenuti è emerso che le prime non riescono a sopravvivere a tali stimolazioni a differenza delle seconde, a dimostrazione e conclusione del fatto che Pkc1, non solo è importante per assicurare la trasmissione del segnale nella cascata di segnalazione cellulare, ma è anche essenziale per il mantenimento dell'integrità della parete cellulare, e quindi, per la sopravvivenza cellulare.