Analisi della correlazione genotipo-fenotipo attraverso modelli funzionali di ADPKD

Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is the most common form of inherited disease leading to kidney failure and is characterized by strong clinical heterogeneity. Almost 80% of ADPKD cases are caused by germline variants in the PKD1 gene, a significant proportion of which are classified as ‘variant of unknown significance’ (VUS). The aim of this thesis was to functionally validate cellular models, generated by genome editing techniques, to mimic different mutations in the PKD1 gene. The progression of ADPKD is in line with the ‘double hit’ disease hypothesis, e.g., double inactivation, so the models used were, in addition to a wild-type (WT) control clone, a knock-out on exon 15 (Ex15-/-) and homozygous/compound heterozygous clones carrying variants on exon 15 and/or exon 42 (Ex15+/+42M/M and Ex15+/-42M/M). The transcriptional profile of the Ex15-/- and Ex15+/-42M/M clones was similar, and a gene ontology analysis revealed dysregulation in autophagy, cell cycle regulation and cytoskeleton organization processes compared to the WT. Functional validation of these pathways showed that the Ex15-/- and Ex15+/-42M/M clones were characterized by a poor actin polymerization capacity with altered cell adhesion, a defect in the autophagic flux and lower oxygen consumption rate probably due to metabolic reprogramming. Overall, these data suggest that homozygous or compound heterozygous variants made of missense together with deleterious mutations drive the pathological phenotype. These results highlight also the role played by the different functional protein domains affected by the variants, as underlined by the lack of differences among the clones when considering the cell cycle. Taken together, this work demonstrates the functional impact of different variants in the PKD1 gene and, consequently, on patients phenotype.

Il rene policistico autosomico dominante (ADPKD) è la più comune forma di malattia ereditaria che porta all'insufficienza renale, ed è caratterizzato da una forte eterogeneità clinica. Quasi l'80% dei casi di ADPKD è determinato da varianti germinali nel gene PKD1, una proporzione significativa delle quali è classificata come "variante di significato incerto" (VUS). L’obiettivo di questa tesi è stato quello di validare funzionalmente modelli cellulari, generati mediante tecniche di genome editing, per riprodurre diverse mutazioni a carico del gene PKD1. La progressione dell’ADPKD è in linea con un modello di malattia “a doppio colpo”, ossia di doppia inattivazione, quindi i modelli impiegati sono stati, oltre ad un clone wild-type (WT) di controllo, un knock-out sull’esone 15 (Ex15-/-) e degli omozigoti/eterozigoti composti, recanti varianti sull’esone 15 e/o sull’esone 42 (Ex15+/+42M/M ed Ex15+/-42M/M). Il profilo trascrizionale dei cloni Ex15-/- e Ex15+/-42M/M è risultato simile, e un’analisi di gene ontology ha evidenziato una disregolazione nei processi autofagici, di regolazione del ciclo cellulare e di organizzazione del citoscheletro rispetto alla condizione WT. La validazione funzionale di questi termini ha evidenziato che i cloni Ex15-/- e Ex15+/-42M/M sono caratterizzati da una scarsa capacità di polimerizzazione dell’actina con alterata adesione cellulare, un difetto nel flusso autofagico e un minor consumo di ossigeno dovuto a una probabile riprogrammazione metabolica. I risultati di questi saggi suggeriscono che varianti omozigoti o varianti in eterozigosi composta che combinano varianti missenso con varianti deleterie guidano il fenotipo patologico. I risultati evidenziano inoltre il ruolo dei diversi domini funzionali interessati dalle varianti, come sottolineato dalla mancanza di differenze tra i diversi cloni a livello del ciclo cellulare. Complessivamente, i risultati dimostrano come diverse varianti nel gene PKD1 possano influenzare l'attività della policistina-1 e, di conseguenza, il fenotipo del paziente.