Instabilità dei microsatelliti, mutazioni dei geni BRAF e KRAS nel cancro ereditario non poliposico del colon retto (HNPCC) e nel carcinoma sporadico del colon retto

In genetica molecolare un microsatellite è un tratto di DNA ripetuto molte volte, caratterizzato da una sequenza di alcuni nucleotidi ripetuta in gruppi sparsi in tutto il genoma, con lunghezza variabile da individuo ad individuo. I microsatelliti sono, quindi, dei marcatori molecolari particolarmente polimorfici e ipervariabili, che rappresentano uno strumento utile in termini di identificazione personale biologica. L'utilizzo di questi sistemi genetici, con particolare riferimento agli short tandem repeats (STR), negli ultimi anni ha suscitato particolare interesse anche in campo oncologico, potendo rappresentare importanti markers indicativi della presenza o meno di una neoplasia benigna e/o maligna. In particolare, il loro studio è stato importante sia per quanto riguarda i processi di carcinogenesi che per quanto riguarda l'individuazione di marcatori molecolari delle neoplasie maligne: all'interno di queste sequenze genetiche ripetute, si instaurano delle variazioni e modificazioni genetiche importanti determinate dal processo neoplastico vero e proprio. L'instabilità dei microsatelliti riveste un ruolo importante nei processi di carcinogenesi, con particolare riferimento agli errori di replicazione, soprattutto nei tumori maligni e benigni con evoluzione verso la malignità (adenomatosi, polipoide del colon o FAP) del colon, del sigma e del retto, potendosi manifestare sia nella neoplasia maligna di origine germinale, come nel carcinoma ereditario non poliposico del colon-retto (HNPCC) nella S.Lynch, che in quella somatica-sporadica. Presso la S. S. di Genetica e di Biologia Molecolare dell'A.S.O. S. Croce e Carle l'analisi per l'identificazione dell'instabilità dei microsatelliti è stata eseguita sia in casi di carcinoma del colon-retto HNPCC sia su casi di carcinoma sporadico del colon-retto, arruolati in modo random. Contemporaneamente sono state ricercate le mutazioni somatiche dei geni KRAS, BRAF e NRAS note per il loro significato prognostico e predittivo di risposta terapeutica. Lo scopo del lavoro è stato quello di valutare la presenza di instabilità dei microsatelliti anche nei carcinomi sporadici del colon-retto ed in modo speculare valutare la presenza delle mutazioni somatiche anche nei carcinomi della S.Lynch. Nella S. C. di Anatomia Patologica sono state eseguite le colorazioni immunoistochimiche per l'analisi dell'espressione della proteine MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 nei casi di instabilità micro satellitare. Per quanto concerne l'analisi di instabilità dei micro satelliti (MSI), è stato utilizzato DNA estratto da tessuto tumorale e sano del medesimo paziente tramite metodica automatica utilizzando lo strumento Maxwell® RSC (Promega), quantificato con il dispositivo Quantifluor® (Promega). La metodica utilizzata è MSI Analysis System 1.2, che prevede l'applicazione tramite PCR, utilizzando primer fluorescenti, di 5 mononucleotidi ripetuti (BAT-25, BAT-26,NR-21, NR-24 e MONO-27) e di due penta nucleotidi ripetuti (Penta C e Penta D). I prodotti di PCR sono separati con elettroforesi capillare utilizzando il sequenziatore automatico ABI PRISM® 3100 e analizzati con software GeneMapper® per determinare lo stato MSI. I vetrini per l'immunoistochimica sono stati colorati con l'immunocoloratore automatico Dako Omnis® utilizzando gli anticorpi MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 della medesima ditta Dako.