Immobilizzazione di un enzima batterico su nanoparticelle di ossido ferro per la produzione di metaboliti di farmaci umani.

The Baeyer-Villiger monooxygenase from Acinetobacter radioresistens (Ar-BVMO) is a bacterial enzyme capable of catalyzing both Baeyer-Villiger oxidation and heteroatom oxidation, including S- and N-oxidation. In the human liver, heteroatom oxidation is a crucial process in Phase I drug metabolism. One of the main enzyme families involved in this step are flavin-containing monooxygenases (FMO), particularly FMO3 in the human liver. Sufficient quantities of drug metabolites are essential in the drug discovery and development process, especially for preclinical and clinical evaluations of new therapeutic compounds. FMOs have received significant attention in this aspect, as they are not readily induced or inhibited by environmental factors, resulting in minimal adverse drug-drug interactions and production of toxic compounds compared to the other phase I enzyme family, cytochromes P450. Compared to Ar-BVMO, hFMO3 has a more complex purification process since it is anchored to the ER membrane of hepatocytes and therefore it is not soluble. Ar-BVMO has previously been shown in our lab to have similar substrates as those of its human counterpart, hFMO3. Therefore, the bacterial enzyme Ar-BVMO presents a promising alternative to human FMOs for drug metabolite production. The aim of this project was to demonstrate that Ar-BVMO immobilised on bare iron oxide nanoparticles (BIONs) are able to act as a recyclable biocatalyst, providing a cost-effective and environmentally friendly system for generating drug metabolites. To this end, the enzyme was first purified using affinity chromatography and different conditions were tested for its immobilisation on BIONs. In order to confirm the activity of the immobilised enzyme, initially a known substrate of the enzyme was used i.e. butyl levulinate followed by the anti-tuberculosis drug, ethionamide. The data obtained demonstrate the feasibility of reusing the enzyme-nanoparticle system for up to eight catalytic cycles without significant loss of activity, offering a sustainable approach to producing drug metabolites in sufficient quantities.

La monossigenasi Baeyer-Villiger da Acinetobacter radioresistens (Ar-BVMO) è un enzima batterico capace di catalizzare la relazione di Bayer-Villiger ed ossidazioni di eteratomi, incluse ossidazioni S- ed N-. Nel fegato umano, l’ossidazione degli eteratomi è un processo cruciale nel metabolismo dei farmaci di Fase I. Una delle principali famiglie di enzimi coinvolte in questo processo è quella delle monossigenasi contenente flavina (FMO), in particolare FMO3 nel fegato umano. Quantità sufficienti di metaboliti dei farmaci sono essenziali nel processo di scoperta e sviluppo dei farmaci, in particolare per valutazioni precliniche e cliniche di nuovi composti terapeutici. Le FMO hanno ricevuto attenzioni significative da questo punto di vista, in quanto non sono facilmente indotte o inibite da fattori ambientali, risultando in minime reazioni avverse farmaco-farmaco e produzione di composti tossici in confronto all’altra famiglia di enzimi di Fase I, quella del citocromo P450. Rispetto all’Ar-BVMO, hFMO3 ha un processo di purificazione più complesso, in quanto è ancorato alla membrana del reticolo endoplasmatico degli epatociti, e pertanto non è solubile. Pertanto, l’enzima batterico Ar-BVMO presenta un’alternativa promettente alle FMO umane per la produzione di metaboliti dei farmaci. L’obiettivo di questo progetto è quello di dimostrare che l’Ar-BVMO immobilizzata su nanoparticelle di ossido di ferro non rivestite (BIONs) può agire come un biocatalizzatore riciclabile, fornendo un sistema economicamente efficiente ed ambientalmente sostenibile per generare metaboliti dei farmaci. A questo scopo, l’enzima è stato dapprima purificato usando la cromatografia d’affinità, e diverse condizioni sono state testate per l’immobilizzazione su BION. Per confermare l’attività dell’enzima immobilizzato, inizialmente è stato utilizzato un substrato noto dell’enzima (i.e. butil levulinato), seguito dal farmaco anti-tubercolosi etionamide. I dati ottenuti dimostrano la fattibilità del riutilizzo del sistema enzima-nanoparticella per fino ad otto cicli catalitici senza significante perdita di attività, offrendo un approccio sostenibile alla produzione di metaboliti dei farmaci in quantità sufficienti.