Attività dell' enzima ADO nella produzione di biocombustibili: ingegnerizzazione della via metabolica per incrementare la resa di alcani

Grazie alle loro caratteristiche che li rendono equiparabili ai combustibili fossili, i biocombustibili, ricavati specialmente dai cianobatteri, sono particolarmente adatti per poter sostituire quelli tradizionali. La via metabolica utilizzata dal phylum dei cianobatteri comprende due enzimi: l’ossigenasi deformilante aldeidica (ADO) e l’ACP-acil reduttasi (AAR) che, lavorando in sinergia, producono alcano e formiato; il primo è il prodotto principale e svolge diverse funzioni fisiologiche; il formiato, invece, è un coprodotto. AAR appartiene alla classe delle ossidoreduttasi ed è costituito da un’alternanza di filamenti beta e alfa eliche. Catalizza la reazione che trasforma la catena acilica nella corrispettiva aldeide, sfruttando il potere riducente di NADPH. ADO è un enzima metallo dipendente caratterizzato da otto alfa eliche. Il substrato è l’aldeide che subisce una decarbossilazione mentre è ospitata all’interno di una tasca idrofobica a forma di “T”. Le interazioni elettrostatiche tra l’elica 7 di ADO e il dominio N-terminale di AAR consentono un’attività sinergica tra i due enzimi. Un canale a forma di “L” in AAR ospita il NADPH e la catena acilica, che viene ridotta nell’aldeide; questa percorre il tunnel fino all’interfaccia con ADO, dove continua in una tasca a forma di “T” per potersi inserire nel sito attivo e trasformarsi in alcano e formiato. Poiché la bassa costante catalitica di ADO non permette una resa ottimale, sono necessari interventi esterni per incrementare la concentrazione del prodotto finale. È possibile aggiungere una formiato deidrogenasi alla via metabolica, che svolge due funzioni: la prima è ossidare il formiato a CO2 per poter rigenerare il NADPH, necessario per la catalisi di ADO, la seconda è innalzare il pH per rendere l’ambiente più adatto alla sintesi di alcani. La formiato deidrogenasi più adatta è quella isolata da Xanthobacter, le cui caratteristiche consentono di ottenere una quantità di tridecano di ~426 µM in 10 h. L’enzima ADO presenta un tag di degradazione nell’elica C-terminale, che ha il ruolo di degradare l’enzima quando non ce n’è bisogno, ma la sua assenza comprometterebbe la sintesi di alcani. La mancanza del tag ha due conseguenze: l’attività specifica diminuisce ma la concentrazione dell’enzima aumenta. Visto che l’eliminazione del tag, nel lungo termine, altera l’affinità con il substrato e la rimozione delle peptidasi ha un effetto negativo sulla sopravvivenza della cellula, una soluzione sarebbe aggiungere una “protezione”: l’aggiunta di 6 His-tag permette di aumentare quasi del doppio la resa di alcano. L’aldeide reduttasi (ALR) è un altro enzima che compete con ADO, in quanto hanno lo stesso substrato: questo porterebbe a una diminuzione della concentrazione finale di alcano perché l’aldeide verrebbe sottratta a ADO da parte di ALR. Dei ceppi knock-out per questo enzima migliorano notevolmente la produzione, fino a 170 mg/L. La delezione di ALR può essere combinata con la sovraespressione di alcuni enzimi coinvolti nella sintesi di acidi grassi, dal momento che il substrato di AAR è una catena acilica. Quindi la combinazione della sovraespressione del regolatore del metabolismo (FadR) con la delezione di ALR porta ad aumentare ancora di più la produzione di alcani, che raggiunge 1009 mg/L dopo 24 h.