Metaboliti vegetali: strategie per la loro quantificazione

Plant primary and specialized metabolites have always been used by humans because of their nutritional and therapeutic effects. Plant extracts are a combination of a plethora of metabolites which make their analysis difficult and challenging, even with the most innovative analytical techniques. This thesis is addressed to the use of reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) for the quantitative analysis of natural compounds using different detection systems: photodiode array (PDA) and tandem mass spectrometry (MS/MS) with different acquisition modes (selected ion monitoring (SIM) and selected reaction monitoring (SRM)). Some phenolic compounds belonging to flavonoids (kaempferol, luteolin, apigenin glycosides, catechin and epicatechin) and phenolic acids (chlorogenic acid, criptochlorogenic acid) and two triterpene acids (ursolic acid and oleanolic acid) were selected and quantified by HPLC-PDA-MS/MS. In this study, the advantages and disadvantages of each acquisition mode will be shown, depending on the molecule being analysed. A special focus will be addressed to the quantification of compounds for which a reference commercial standard is not available. Quantifying a compound using the calibration curve-built with the reference standard of another molecule, with similar UV or MS characteristics, can lead to quantification inaccuracies. To evaluate the potential quantification errors performed for compounds devoid of the commercial authentic standard, the analytes considered in this work have been quantified by using a calibration curve prepared with a different compound belonging to the same chemical class and with a similar chemical structure, this procedure is mentioned in the thesis as cross quantification. At the same time, to simulate the complexity of compounds quantification in a plant extract a real case of coelution is evaluated and a case of cross quantification of chlorogenic acid using a plant extract of a wild thistle (Onopordum illyricum L.) is also proposed. The quantification with PDA has been performed at the maximum absorption wavelength compatible for each class of compounds: 350 nm for kaempferol and luteolin glucosides, 325nm for chlorogenic acids, 330 nm for apigenin C-glycosides, 280 nm for catechin and epicatechin, 220 nm for triterpenes. A calibration curve was constructed for each compound with the reference standard and the quantification of 2.5 μg/mL (except for triterpenes, which were quantified at 25 ug/mL considering the LOQ) has been carried out with the reference standard and one or more compounds with similar characteristics. The same approach used for PDA was extended to the quantification in SIM, both in positive and negative acquisition modes, except for triterpenic acids for which only SIM+ was performed. After identifying characteristic and common fragments, the same approach was used for quantification in SRM+ and SRM- for all compounds and for triterpenic acids only SRM+. For each acquisition mode, the best result for each compound is generally obtained using the reference standard. The most appreciable results for cross quantification are obtained in PDA, since it is not very specific but is not applicable in the case of co-elution, so in this case the SIM or SRM mode must be used. These modes are very specific and therefore less versatile and may lack accuracy due to ion instability, especially of the positive ion (as can be observed in the case of catechin and epicatechin).

I metaboliti primari e specializzati delle piante sono sempre stati utilizzati dall'uomo per gli effetti nutrizionali e terapeutici. Gli estratti vegetali contengono numerosi metaboliti che rendono la loro analisi difficile e impegnativa, anche con tecniche analitiche innovative. Questa tesi è volta all'uso della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per l'analisi quantitativa di composti naturali usando diversi sistemi di rivelazione: photodiode array (PDA) e spettrometria di massa tandem (MS/MS) con diverse modalità di acquisizione (Selected Ion Monitoring (SIM) e Selected Reaction Monitoring (SRM)). Alcuni composti fenolici della classe dei flavonoidi (canferolo, luteolina, apigenina glicosidi, catechina ed epicatechina), degli acidi fenolici (acido clorogenico, acido criptochlorogenico) e due acidi triterpenici (acido ursolico e acido oleanolico) sono stati selezionati e quantificati tramite HPLC-PDA-MS/MS. In questo studio verranno illustrati vantaggi e svantaggi di ogni modalità di acquisizione, in base alla molecola da analizzare. Particolare attenzione sarà rivolta al quantificare composti il cui standard commerciale di riferimento non è disponibile. Quantificare un composto utilizzando la retta di taratura costruita con lo standard di riferimento di un'altra molecola, con caratteristiche UV o MS simili, può rendere la quantificazione imprecisa. Per valutare i potenziali errori di quantificazione per composti privi di standard commerciale, gli analiti sono stati quantificati utilizzando una retta di taratura di un composto diverso ma appartenente alla stessa classe chimica e con struttura simile e ciò sarà indicato come quantificazione incrociata. Per simulare la complessità della quantificazione dei metaboliti vegetali è stato valutato un caso reale di coeluizione e uno di quantificazione incrociata dell’acido clorogenico utilizzando un estratto vegetale di Onopordum illyricum L. La quantificazione in PDA è stata eseguita alla massima lunghezza d'onda di assorbimento: 350 nm per il canferolo e i glucosidi della luteolina, 325 nm per gli acidi clorogenici, 330 nm per i C-glicosidi dell'apigenina, 280 nm per la catechina e l'epicatechina, 220 nm per i triterpeni. Costruita la retta di taratura per ogni composto con lo standard di riferimento, la quantificazione di 2,5 μg/mL (25 ug/mL considerando il LOQ per i triterpeni) è stata effettuata con lo standard di riferimento e con uno o più composti con caratteristiche simili. Lo stesso approccio utilizzato in PDA è stato esteso per quantificare in SIM, in modalità di acquisizione positiva e negativa, ad eccezione degli acidi triterpenici (solo SIM+). Dopo aver identificato i frammenti caratteristici e comuni, lo stesso approccio è stato utilizzato per la quantificazione in SRM+ e SRM- per tutti i composti, per gli acidi triterpenici solo SRM+. Per ogni modalità di acquisizione, il risultato migliore per ciascun composto si ottiene generalmente utilizzando lo standard di riferimento. Per la quantificazione incrociata, i risultati più apprezzabili si hanno in PDA, perché risulta essere meno specifico. La quantificazione con PDA non è applicabile nel caso di una coeluizione, in tal caso è necessario utilizzare la modalità SIM o SRM. Queste modalità hanno il vantaggio di essere più specifiche ma meno versatili e hanno accuratezza più bassa per fenomeni di instabilità dello ione, soprattutto dello ione positivo (come è possibile osservare per catechina ed epicatechina).