Validazione di un metodo di genotipizzazione multiplex per l'analisi dei polimorfismi del gene della Tiopurina S-Metiltransferasi

ABSTRACT Background: The human TPMT gene exhibits genetic polymorphism and 90% of Caucasians inherit high TPMT activity, 10% intermediate TPMT activity and 0.3% low TPMT activity. The aim of the present study was to validate a TaqMAMA genotyping multiplex PCR assay TPMT-MAMAPCR for detection of TPMT genetic polymorphisms. Methods The TPMT multiplex MAMAPCR real time Kit allows a simple, fast and safe testing of human DNA for the presence of a clinically relevant genetic variant in the TPMT gene. The reagents contain primers for the amplification of particular regions of the human TPMT gene as well as fluorescence labelled probes for the detection of genetic variants at nucleotide positions nt 238 in exon 5, nt 460 in exon 7 and nt 719 in exon 10. To validate the accuracy of the allele-specific multiplex real-time PCR genotyping method, we performed both PCR-direct sequencing and TaqMAMA multiplex PCR real-time. Subsequently we used this assay in 119 thiopurine treated children for a pivotal clinical validation. Results: We used an automatic algorithm for the interpretation of real-time PCR results based on the Ct differences with excel platform (Table 4). This application can reduce errors and is time-efficient and can be connected to a laboratory information system to automatically generate pharmacogenetic interpretation reports. A total of 116 subjects (97,5%) did not carry any of the tested SNPs and was homozygous for the wild-type allele (TPMT*1).Three subjects (2.5%) were heterozygous for one of the mutant alleles (namely TPMT*3A), so they were TPMT*1/TPMT*3A. No homozygous form of any mutant allele was detected in the test subjects.. Conclusions: In conclusion, a novel type of AS-PCR, name multiplex TaqMAMA real time PCR, was used and validated in the present study. This technique completely eliminated non-specific amplification in simple and direct way. This suggests that could serve as a powerful and robust routine genotyping tool for analysis of SNPs in a single tube. Key words: TaqMAMA, TPMT*2 (c.238G>C), TPMT*3A (c.460G>A, c.719A>G) and TPMT*3C (c.719A>G).

ABSTRACT Premessa: Il gene umano TPMT presenta un polimorfismo genetico tale per cui il 90% dei caucasici eredita un'attività TPMT elevata, il 10% un'attività TPMT intermedia e lo 0,3% una bassa attività TPMT. Lo scopo del presente studio è stato quello di convalidare un saggio di genotipizzazione TaqMAMA multiplex PCR TPMT-MAMAPCR per la rilevazione dei polimorfismi genetici di TPMT. I metodi: Il kit TPMT multiplex real time MAMAPCR consente di analizzare in modo semplice, rapido e sicuro il DNA umano per verificare la presenza di una variante genetica clinicamente rilevante nel gene TPMT. I reagenti contengono primer per l'amplificazione di particolari regioni del gene TPMT umano e sonde marcate in fluorescenza per l'individuazione di varianti genetiche nelle posizioni nucleotidiche nt 238 nell'esone 5, nt 460 nell'esone 7 e nt 719 nell'esone 10. Per convalidare l'accuratezza del metodo di genotipizzazione allele-specifico con PCR multiplex in tempo reale, abbiamo eseguito sia il sequenziamento diretto con PCR sia la PCR multiplex real time TaqMAMA. Successivamente, abbiamo utilizzato questo test in 119 bambini trattati con tiopurina per una validazione clinica cardine. Risultati: Abbiamo utilizzato un algoritmo automatico per l'interpretazione dei risultati della real time PCR basato sulle differenze dei Ct con la piattaforma excel (Tabella 4). Questa applicazione può ridurre gli errori, è efficiente in termini di tempo e può essere collegata a un sistema informativo di laboratorio per generare automaticamente rapporti di interpretazione farmacogenetica. Un totale di 116 soggetti (97,5%) non era portatore di nessuno degli SNP testati ed era omozigote per l'allele wild-type (TPMT*1). Tre soggetti (2,5%) erano eterozigoti per uno degli alleli mutanti (ossia TPMT*3A), quindi erano TPMT*1/TPMT*3A. Nei soggetti esaminati non è stata rilevata alcuna forma omozigote di un allele mutante. Conclusioni: In conclusione, nel presente studio è stato utilizzato e validato un nuovo tipo di AS-PCR, denominato multiplex TaqMAMA real time PCR. Questa tecnica ha eliminato completamente l'amplificazione non specifica in modo semplice e diretto. Ciò suggerisce che potrebbe servire come potente e robusto strumento di genotipizzazione di routine per l'analisi degli SNP in una singola provetta. Parole chiave: TaqMAMA, TPMT*2 (c.238G>C), TPMT*3A (c.460G>A, c.719A>G) e TPMT*3C (c.719A>G).