Ruolo dei citocromi P450 nelle epatopatie

In the first part of the thesis, the physiological role of the CYP2E1 enzyme and that in both alcoholic and non-alcoholic liver diseases is addressed, while the second part deals with new therapies and prevention strategies. CYP2E1 was isolated by the discovery of an ethanol-dependent increase in the oxidation mediated by this enzyme. There are two isoforms of CYP2E1, one in the endoplasmic reticulum and the other in the mitochondria, both with the same catalytic activity. CYP2E1 can metabolize ketone bodies and fatty acids, but also ethanol, generating in this case reactive oxygen species (ROS) and inducing lipid peroxidation and mitochondrial dysfunction. The high spin nature of CYP2E1’s eme Fe has made this enzyme unique because it can directly reduce substrates, such as oxygen, producing ROS. The physiological role of mtCYP2E1 is still unknown, but some hypotheses have been made about the same functions as CYP2E1. The mechanism of regulation for the latter concerns the enzymatic stabilization induced by the substrate to prevent its degradation through the proteasome. The regulation of CYP2E1’s targeting in the mitochondria is poorly known, but some studies have identified some factors that control it, such as glucagon which activates protein kinase A (PKA). The "multiple parallel hit" model helped to explain the onset and progression of non-alcoholic fatty liver disease associated with obesity (NAFLD) and suggested that environmental and genetic problems, such as insulin resistance, oxidative stress-induced mitochondrial dysfunction and lipid accumulation may increase CYP2E1 expression and its activity in NAFLD. Possible new therapies include the use of antioxidants. Wistar rats were used to test the effects of treatment with plant extracts containing chlorogenic acid (CGA), an antioxidant and a free radical scavenger because they are susceptible to ethanol-induced liver steatosis. Data showed that treatment with CGA reduces the accumulation of ROS and lipid peroxidation, inhibiting oxidative stress. Both doses of CGA used in the study decrease the expression of the proinflammatory genes TLR4, Nf-kB, TNFα, IL-1β and IL-6, preventing progression of alcoholic liver steatosis in rats and subsequent inflammation. Cladonia rangiferina is a class of lichens that has antioxidant and anti-inflammatory activities. Again, Wistar rats were used to assess their effect on ethanol-induced liver damage, noting that the ethanol and CRE group showed an increase in antioxidants such as GSH, GR and GST compared to the ethanol-only group. Finally, the results of a study are presented where to reduce the high toxicity of acetaminophen (AAP), an effective antitumor but with high toxicity, N-acetylcysteine and fomepizole are used as an additional therapy. Fomepizole is an inhibitor of CYP2E1, in fact it prevents the formation of the reactive intermediate N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) induced by AAP and the resulting hepatotoxicity. The results showed a 50% decrease in tumor growth in mice treated with AAP as well as those treated with NAC and fomepizole alone. The combination of AAP, NAC and fomepizole maintains the antitumor activity of AAP but reduces its hepatotoxicity.

Nella prima parte della tesi viene affrontato il tema del ruolo fisiologico dell’enzima CYP2E1 e quello nelle epatopatie sia alcoliche che non, mentre la seconda parte tratta le nuove terapie e le strategie di prevenzione. CYP2E1 è stato isolato tramite la scoperta di un aumento dipendente dall’etanolo nell’ossidazione mediata da questo enzima. Esistono due isoforme di CYP2E1, una presente nel reticolo endoplasmatico, mentre l’altra nei mitocondri, entrambe con la stessa attività catalitica. CYP2E1 può metabolizzare corpi chetonici e acidi grassi, ma anche etanolo, generando in questo caso specie reattive dell’ossigeno (ROS) e inducendo perossidazione lipidica e disfunzione mitocondriale. La natura ad alto spin del Fe dell’eme di CYP2E1 ha reso questo enzima unico perché può ridurre direttamente i substrati, come l’ossigeno, producendo ROS. Invece il ruolo fisiologico di mtCYP2E1 è ancora sconosciuto, però alcune ipotesi hanno riguardato le stesse funzioni di CYP2E1. Il meccanismo di regolazione per quest’ultimo riguarda la stabilizzazione enzimatica indotta dal substrato per impedire la sua degradazione tramite il proteasoma. La regolazione dell’indirizzamento nel mitocondrio di CYP2E1 è poco conosciuta, però alcuni studi hanno identificato alcuni fattori che la controllano, come il glucagone che attiva la proteina chinasi A (PKA). Il modello “multiple parallel hit” ha consentito di spiegare l’inizio e la progressione della steatosi epatica non alcolica associata all’obesità (NAFLD) e ha suggerito che i problemi ambientali e genetici, come l’insulino-resistenza, la disfunzione mitocondriale indotta da stress ossidativo e l’accumulo lipidico possono aumentare l’espressione di CYP2E1 e la sua attività nel NAFLD. Le possibili nuove terapie prevedono l’utilizzo di antiossidanti. Per verificare gli effetti del trattamento con estratti vegetali contenenti acido clorogenico (CGA), un antiossidante e uno scavenger di radicali liberi, sono stati usati ratti Wistar perché sono suscettibili alla steatosi epatica indotta da etanolo. I dati hanno dimostrato che il trattamento con CGA riduce l’accumulo di ROS e la perossidazione lipidica, inibendo lo stress ossidativo. Entrambe le dosi di CGA utilizzate nello studio diminuiscono l’espressione dei geni proinfiammatori TLR4, Nf-kB, TNFα, IL-1β e IL-6, impedendo la progressione della steatosi epatica alcolica nei ratti e la conseguente infiammazione. Cladonia rangiferina è una classe di licheni che presenta attività antiossidanti e antinfiammatorie. Anche in questo caso per valutare il loro effetto sul danno epatico indotto da etanolo sono stati usati ratti Wistar, osservando che il gruppo trattato con etanolo e CRE mostra un aumento di antiossidanti come GSH, GR e GST, rispetto al gruppo trattato solo con etanolo. Infine, sono presentati i risultati di uno studio dove per ridurre l’elevata tossicità di acetaminofene (AAP), un antitumorale efficace, ma con elevata tossicità, N-acetilcisteina e fomepizolo sono usati come una terapia aggiuntiva. Il fomepizolo è un inibitore di CYP2E1, infatti impedisce la formazione dell’intermedio reattivo N-acetil-p-benzochinone imina (NAPQI) indotta da AAP e la conseguente epatotossicità. I risultati hanno dimostrato una diminuzione del 50% nella crescita tumorale nei topi trattati con anche AAP rispetto a quelli trattati con solo NAC e fomepizolo. La combinazione di AAP, NAC e fomepizolo permette di mantenere l’attività antitumorale di AAP, riducendone però l’epatotossicità.