Analisi qualitativa e quantitativa di ossitocina e cortisolo in urina di bonobo

It’s well known how oxytocin (OT) and cortisol, or hydrocortisone (HC), take part in communication pathways present in different animals. For instance, Pan Paniscus (bonobos), hominoid primate, is a good example for social interaction studies. Oxytocin is a neuropeptide hormone, acknowledged for its role in parturition, social bonding, and stress regulation. On the other hand, cortisol , a steroid hormone, is usually measured as biomarker of stress. The aim of this study was to quantify these two molecules, very chemically heterogeneous in bonobo urine, a suitable and non-invasive matrix, through two LC-MS methods. Sensitive and specific quantification methods are fundamental to quantify these analytes due to their low abundances in biological fluids (pg/mL and ng/mL for OT and HC respectively). A fractionated LLE (liquid-liquid extraction) with TBME (tert-butyl methyl ether) was carried out as sample pre-treatment for HC. Dried extracts were subjected to HPLC equipped with online SPE followed by C18 analytical column. HPLC system was coupled with a QTrap mass analyser used in triple quadrupole MRM (multiple reaction monitoring) mode both for HC and HC-d3 used as internal standard. Instead, an offline SPE (solid phase extraction) with a polymeric reverse phase cartridge was used both to enrich and to purify OT extracts. Dried extracts were subjected to nanoHPLC with a C18 pre-concentration cartridge. The analytical column with an integrated emitter was linked with a HRMS (Tribrid Orbitrap Fusion). The HRMS operated applying a full scan and a MS2 experiment by CID fragmentation activation mode was used to obtain b and y fragments series of OT and OT-d5 (internal standard) double charged precursor ions. A surrogate matrix was used as calibration medium to quantify analytes in urine. HC was detected in 142 samples with average level of 36.19 ng/mL; OT was detected in 28 samples with average of 0.043 pg/mL. Both methods provided efficient separation, high sensitivity, and specificity to detect hormones in bonobo urine. Despite the great potential offered by the instrumental setup, the setting of the OT analyte in samples presents further challenges given by the low abundance of latter in the analyzed matrix. To detect OT in a greater number of samples, extraction methods will be investigated to achieve greater analytical sensitivity.

È noto come l’ossitocina (OT) e il cortisolo, o idrocortisone (HC), siano parte fondamentale delle interazioni sociali fra animali della stessa specie. In particolar modo, le comunità di Pan Paniscus (bonobo), primati ominoidei, rappresentano un esempio di caso di studio in questo ambito. L’ossitocina è un neuropeptide ed è conosciuta per il suo ruolo nel parto, nei rapporti sociali e nella regolazione dello stress, di cui il cortisolo, ormone steroideo, è il biomarcatore. Lo scopo di questo studio è quello di quantificare, attraverso due metodi di LC-MS, queste molecole chimicamente eterogenee nei campioni di urina di bonobo, una matrice disponibile e dal prelievo non invasivo. Sono necessari metodi di quantificazione sensibili e specifici per la poca abbondanza dei due analiti in questo fluido biologico (pg/mL e ng/mL per OT e HC rispettivamente). Per poter estrarre l’HC dall’urina è stata eseguita una LLE (estrazione liquido-liquido) con TBME (tert-butil metil etere), quindi i campioni sono stati iniettati in un HPLC equipaggiato con una SPE online e seguita da una colonna C18. Il sistema HPLC è accoppiato con un analizzatore di massa QTrap utilizzato in modalità di triplo quadrupolo MRM (multiple reaction monitoring) sia per l’analisi dell’HC sia per quella dell’HC- d3, usato come standard interno. Per purificare e arricchire gli estratti di OT, invece, è stata eseguita una SPE (estrazione in fase solida) offline con una cartuccia polimerica a fase inversa. Gli estratti così pretrattati sono stati iniettati in una nanoHPLC con una colonna di pre-concentrazione C18. La colonna analitica vera e propria, che contiene un emettitore integrato, è collegata ad un HRMS (Tribrid Orbitrap Fusion), che esegue un esperimento di full scan e un MS2 tramite la modalità di frammentazione CID per ottenere serie di frammenti b e y degli ioni con doppia carica OT e OT-d5 (standard interno). Come mezzo di calibrazione per quantificare gli analiti nelle urine è stata utilizzata una matrice artificiale. Sono stati analizzati 142 campioni in totale: HC è stato determinato nella maggiorparte dei campioni in una concentrazione media pari a 36.19 ng/mL, mentre l’OT è stata rilevata solo in 28 campioni con una media di 0.043 pg/mL. Nonostante le grandi potenzialità offerte dal setup strumentale, la rilevazione dell’analita OT nei campioni presenta ulteriori sfide date dalla bassa abbondanza di quest’ultimo nella matrice analizzata. Allo scopo di rilevare OT in un maggior numero di campioni, verranno implementate le metodiche di estrazione per raggiungere una maggiore sensibilità analitica.