Studio dell’attività antiossidante di composti derivati dalle foglie di Punica Granatum in un modello in vitro di co-coltura.

The imbalance of the redox state between oxidant and antioxidant species, in favor of oxidant species, plays an important role in the development of many diseases, including cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, and cancer. The set of alterations that occur at tissues, cells, and biological macromolecules levels when they are exposed to an excess of oxidizing agents is called oxidative stress. The correct function of antioxidant defenses is therefore essential, and in addition to endogenously derived antioxidant molecules, several exogenous antioxidant molecules can be introduced through the diet to help the endogenous antioxidant defense system. Within this thesis project, the antioxidant properties of total extract of pomegranate leaves and of the two compounds derived from it, ellagic acid and luteolin, were investigated in an in vitro co-culture model made by human umbilical endothelial cells (HUVEC) and human dermal fibroblasts (HDF). The use of a co-culture model allows to better evaluate the influence of cell-cell and cell-microenvironment interactions under the compounds aforementioned. To evaluate the antioxidant activity of ellagic acid (EA), luteolin (LU) and total extract (TE), hydrogen peroxide (H2O2) was used as a pro-oxidant stimulus at a concertation of 750 μM for a total incubation of 5 h. After establishing the non-cytotoxic concentrations of EA, LU, and TE for both cell lines, all the compounds were then tested on cells grown in co-culture (with a 1:2 cell ratio between HDF and HUVEC), both in the presence and absence of the pro-oxidant stimulus. Notably, EA did not show significant activity either as a primary or secondary antioxidant, while LU showed statistically significant activity as a primary antioxidant and as a secondary by using high concentration. The data obtained from cell viability analysis were also confirmed by the analysis of reactive oxygen species (ROS) production using flow cytometry. In contrast to what has been observed on single cell lines, the experiments performed in the co-culture model showed antioxidant activity of LU and not EA. The results obtained need to be further investigated as co-cultures may be a more predictive model of the in vivo activity of the tested compounds.

Il disequilibrio dello stato redox tra le specie ossidanti e quelle antiossidanti, a favore di quelle ossidanti, può giocare un ruolo importante nello sviluppo di molte malattie, tra cui malattie cardiovascolari, neurodegenerative e tumori. L’insieme delle alterazioni che si manifestano a livello di tessuti, cellule e macromolecole biologiche quando queste vengono esposte ad un eccesso di agenti ossidanti viene definito stress ossidativo. Il corretto funzionamento delle difese antiossidanti è quindi fondamentale e, oltre a quelle di derivazione endogena, diverse molecole antiossidanti esogene possono essere introdotte con l’alimentazione, in aiuto del sistema di difesa antiossidante endogeno. All’interno di questo elaborato sono state analizzate le proprietà antiossidanti dell’estratto totale di foglie di melograno e di due composti da esso derivati, l’acido ellagico e la luteolina, in un modello di co-coltura cellulare costituito da cellule endoteliali ombelicali umane (HUVEC) e fibroblasti del derma umano (HDF). L’utilizzo di un modello di co-coltura permette di valutare l’influenza delle interazioni cellula-cellula e cellula-microambiente sulle proprietà dei composti in esame. Per valutare l’attività antiossidante dell’acido ellagico (EA), della luteolina (LU) e dell’estratto totale (TE) è stato utilizzato come stimolo pro-ossidante il perossido di idrogeno (H2O2) ad una concertazione di 750 μM con un’incubazione di 5 h. Dopo aver stabilito le concentrazioni non citotossiche di EA, LU e TE per entrambe le linee cellulari, i vari composti sono stati poi testati sulle cellule cresciute in co-coltura (con rapporto cellulare pari a 1:2 tra HDF ed HUVEC), sia in presenza che in assenza dello stimolo pro-ossidante. In particolare, l’EA non ha dimostrato una significativa attività né come antiossidante primario né come secondario, mentre la LU ha dimostrato un’attività statisticamente significativa come antiossidante primario e come antiossidante secondario usando un’alta concentrazione. I dati ottenuti dall’analisi della vitalità cellulare sono stati confermati inoltre dall’analisi della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) tramite citofluorimetria a flusso. A differenza di quanto osservato sulle singole linee cellulari, gli esperimenti eseguiti in co-coltura hanno evidenziato un’attività antiossidante di LU e non di EA. I risultati ottenuti devono essere ulteriormente approfonditi in quanto le co-colture possono rappresentare un modello più predittivo dell’attività dei composti in vivo.