Agenti causali delle malattie del legno della vite: patogenicità e sviluppo di metodi diagnostici

La vite è ad oggi una delle colture maggiormente estese ed economicamente importanti al mondo. La coltivazione della vite risulta compromessa da differenti organismi, tra cui alcuni funghi xilematici che causano le cosiddette malattie del legno della vite (GTD). Tra le più rilevanti ci sono Mal dell’Esca (o Grapevine Leaf Stripe Disease), causato dagli ascomiceti Phaeoacremonium spp. e Phaeomoniella chlamydospora e il basidiomicete Fomitiporia mediterranea; Eutipiosi, il cui agente patogeno è l’ascomicete Eutypa lata insieme ad altri funghi della famiglia Diatrypaceae; deperimento da Botryosphaeria, causato dalla famiglia di funghi Botryosphaeriaceae. Le infezioni da GTD avvengono soprattutto in seguito a precipitazioni, che stimolano il rilascio di spore e permettono la dispersione nell’ambiente e la colonizzazione di altre piante, nelle quali entrano tramite ferite, che frequentemente derivano dalla potatura. La crescita del micelio nello xilema della vite altera il trasporto linfatico, che causa necrosi settoriali o centrali nel fusto e disseccamento fogliare, ma anche riduzione di biomassa e capillizio radicale; una parte dei sintomi sono dovuti a metaboliti fitotossici fungini. Negli ultimi 30 anni, queste malattie hanno visto una rapida diffusione, che si ritiene essere dovuta al divieto d’uso dell’arseniato di sodio, l’unico agente chimico in grado di controllare il Mal dell’Esca, ma anche all’aumento di piante asintomatiche nel vigneto, che spesso derivano da barbatelle infette già in vivaio. Le malattie del legno della vite rappresentano quindi una delle più grandi sfide per la viticoltura poiché non esistono cultivar in grado di resistere all’attacco del fungo e risultano di gestione particolarmente difficile in quanto le infezioni possono rimanere latenti per lunghi periodi. La diagnosi visiva risulta quindi non attendibile e le viti infette rappresentano una fonte di inoculo per l’intero vigneto, ma anche per i vivai qualora venissero selezionate per la produzione di barbatelle. Inoltre, questi organismi crescono lentamente in condizioni di laboratorio e le infezioni multiple rendono ancora più difficile la diagnosi tramite metodi di microbiologia classica: per questo motivo, si usano sistemi di biologia molecolare, che sono noti per essere in grado di identificare più organismi presenti in un unico campione. Partendo però da tessuti legnosi, è necessario un protocollo di estrazione e purificazione del DNA fungino che riesca ad eliminare gli inquinanti vegetali alteranti della reazione e uno per la diagnosi che permetta di distinguere le specie. In tale contesto, questo lavoro di tesi ha voluto indagare la patogenicità di alcuni organismi associati alle malattie del legno della vite, valutare due kit commerciali per l’estrazione di DNA fungino da campioni di origine vegetale ed ottimizzare i protocolli per l’amplificazione in PCR end-point dei geni β-tub di Phaeomoniella chlamydospora e Eutypa lata utilizzando i primers Pch1/Pch2 e ElQF/ElQR disegnati da Pouzoulet et al., 2013 e Pouzoulet et al., 2017. Dopo aver comprovato la patogenicità degli organismi saggiati, l’efficacia dei metodi di estrazione di DNA è stata confermata tramite amplificazioni in PCR end-point dei geni ITS1-4, mentre con adeguate modifiche del protocollo di amplificazione, i primers Pch1/Pch2 e ElQf/ElQR hanno mostrato buona capacità di discriminazione tra le specie in PCR end-point.