Early reperfusion by percutaneous coronary intervention (PCI) has undoubtedly improved myocardial infarction (AMI) patient’s outcomes; however, the prevention of ischemia/reperfusion (I/R) injury is still an unmet need and endothelial injury is still an inevitable complication. To face these hurdles and improve patient’s outcomes, novel pharmacological and interventional approaches posed great attention to paracrine mediators, including extracellular vesicles (EVs). EVs have been recognized as a cellular communication tool with cardioprotective properties in I/R settings. Remote ischemic preconditioning (RIPC) is an adaptive response triggered by brief episodes of ischemia applied during a prolonged coronary occlusion, which seems to have cardioprotective effects. The objective of our study was to elucidate the cardioprotective effect of EV, isolated in patients who had undergone PCI, on hypoxia-reperfusion (H/R) damage in cardiomyoblast H9c2 cell line. We also studied the effects of EV released after RIPC and PCI in the same experimental model. Materials and methods: Patients with unstable angina (UA) and NSTEMI undergoing PCI were randomly assigned into SHAM or RIPC group. EV have been isolated by a precipitation method. EV were analyzed by TEM, their dimension and number were assessed with NanoSight, while the expressions of exosomal markers were evaluated by FACS analysis. Subsequently, EV were administered to H9c2 alone and to H9c2 co-cultured with endothelial cells (HMEC-1). After applying a hypoxia/reoxygenation protocol, cardiomyoblast viability was assessed with MTT assay. Signaling molecules in cardiomyoblast treated with EV were detected by Western blot. EV genetic cargo was detected with an array specific for cardioprotective genes. Results: We analyzed 30 patients (15 RIPC, 15 SHAM). EV isolated by patients of the two groups had similar dimension, number and surface markers. H9c2 cell viability was higher in the RIPC group with respect to the SHAM group; on the contrary, no significant difference between the two groups was detected when co-culture experiments were performed. EV RIPC induced the upregulation of p-Erk-1/2 and Bcl-2 but not changed the expression of p-STAT-3. The analysis of EV cargo showed an increased expression of 5 genes involved in cardioprotection in the RIPC group. Conclusions: Our study showed that EV released after RIPC and PCI protect cardiomyoblasts against H/R damage and inhibit cardiomyoblast apoptosis possibly by upregulating p-Erk-1/2 and Bcl-2. Conversely, p-STAT-3 expression does not seem to be activated after treatment with EV RIPC.
La riperfusione precoce, resa possibile dall’angioplastica coronarica percutanea (PCI), è diventata il cardine della terapia della sindrome coronarica acuta (ACS), migliorandone nettamente la sopravvivenza. Nonostante il perfezionamento delle tecniche di riperfusione, il danno da ischemia-riperfusione (I/R) rimane ad oggi il problema che limita maggiormente il salvataggio dell’area ischemica. In anni recenti, la ricerca di nuove opzioni terapeutiche adiuvanti farmacologiche, interventistiche e basate su cellule e derivati cellulari, ha messo in luce le potenzialità diagnostiche e terapeutiche delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell’ischemia cardiaca. Le EV sono particelle di dimensioni nanometriche delimitate da un doppio strato lipidico e contenenti molecole bioattive, con una funzione di comunicazione intercellulare sia paracrina che endocrina, attraverso il trasporto di materiale genetico e proteico da una cellula all’altra e l’attivazione di segnali intracellulari nelle cellule bersaglio. Tra i meccanismi di cardioprotezione è incluso il pre-condizionamento ischemico remoto (RIPC), che si basa sull’induzione di ripetuti episodi di breve ischemia in un tessuto distale, durante un’occlusione coronarica prolungata, al fine di proteggere il miocardio dal danno da I/R. L’obiettivo del nostro studio è stato studiare l’effetto cardioprotettivo delle EV rilasciate dopo procedura di RIPC e isolate dopo PCI, sul danno da I/R indotto in linee cellulari di cardiomioblasti H9c2. A tale scopo, pazienti con angina instabile (UA) o infarto miocardico in assenza di sopraslivellamento del tratto ST (NSTEMI) candidati a PCI sono stati selezionati, randomizzati, assegnati ai gruppi RIPC e SHAM e, quindi, sottoposti o meno a RIPC. Dal prelievo ematico successivo alla PCI sono state isolate le EV tramite precipitazione. Le EV sono state analizzate al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), la loro dimensione e il loro numero sono stati registrati mediante analisi al Nanosight, mentre l’espressione di marcatori esosomiali è stata valutata con l’analisi FACS. Successivamente, le EV sono state somministrate a colture cellulari di sole H9c2 e a co-colture di H9c2 e cellule endoteliali HMEC-1. Dopo l’applicazione di un protocollo di ipossia/riossigenazione, la vitalità cellulare dei cardiomioblasti è stata valutata con il saggio colorimetrico. L’espressione di molecole di segnale intracellulare nelle H9c2 trattate con EV è stata ottenuta mediante Western Blot. Il materiale genetico contenuto nelle EV è stato analizzato utilizzando un array specifico per geni coinvolti nella cardioprotezione. Abbiamo analizzato i dati di 30 pazienti (15 RIPC, 15 SHAM). Le EV isolate da pazienti dei due gruppi erano simili per dimensione, numero e marcatori di superficie. La vitalità delle cellule H9c2 risultava significativamente aumentata nel gruppo RIPC in confronto al gruppo SHAM; al contrario, la vitalità delle H9c2 in co-coltura con HMEC-1 non ha mostrato una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi. Le EV RIPC hanno indotto un aumento dei livelli di p-Erk-1/2 e Bcl-2, ma non di p-STAT-3, indicando che la loro azione cardioprotettiva sia probabilmente mediata dall’attivazione della via RISK, e non della via SAFE. L’analisi del contenuto genetico delle EV ha dimostrato un’aumentata espressione di 5 geni, coinvolti nella cardioprotezione, nelle EV del gruppo RIPC. Il nostro studio ha dimostrato che le EV rilasciate dopo RIPC e PCI proteggono i cardiomioblasti dal danno da I/R e ne aumentano la vitalità cellulare, probabilmente incrementando i livelli di p-Erk-1/2 e Bcl-2.
Il ruolo delle vescicole extracellulari nei pazienti sottoposti a rivascolarizzazione coronarica per angina instabile e NSTEMI
SARTORETTI, ANNA
2019/2020
Abstract
La riperfusione precoce, resa possibile dall’angioplastica coronarica percutanea (PCI), è diventata il cardine della terapia della sindrome coronarica acuta (ACS), migliorandone nettamente la sopravvivenza. Nonostante il perfezionamento delle tecniche di riperfusione, il danno da ischemia-riperfusione (I/R) rimane ad oggi il problema che limita maggiormente il salvataggio dell’area ischemica. In anni recenti, la ricerca di nuove opzioni terapeutiche adiuvanti farmacologiche, interventistiche e basate su cellule e derivati cellulari, ha messo in luce le potenzialità diagnostiche e terapeutiche delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell’ischemia cardiaca. Le EV sono particelle di dimensioni nanometriche delimitate da un doppio strato lipidico e contenenti molecole bioattive, con una funzione di comunicazione intercellulare sia paracrina che endocrina, attraverso il trasporto di materiale genetico e proteico da una cellula all’altra e l’attivazione di segnali intracellulari nelle cellule bersaglio. Tra i meccanismi di cardioprotezione è incluso il pre-condizionamento ischemico remoto (RIPC), che si basa sull’induzione di ripetuti episodi di breve ischemia in un tessuto distale, durante un’occlusione coronarica prolungata, al fine di proteggere il miocardio dal danno da I/R. L’obiettivo del nostro studio è stato studiare l’effetto cardioprotettivo delle EV rilasciate dopo procedura di RIPC e isolate dopo PCI, sul danno da I/R indotto in linee cellulari di cardiomioblasti H9c2. A tale scopo, pazienti con angina instabile (UA) o infarto miocardico in assenza di sopraslivellamento del tratto ST (NSTEMI) candidati a PCI sono stati selezionati, randomizzati, assegnati ai gruppi RIPC e SHAM e, quindi, sottoposti o meno a RIPC. Dal prelievo ematico successivo alla PCI sono state isolate le EV tramite precipitazione. Le EV sono state analizzate al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), la loro dimensione e il loro numero sono stati registrati mediante analisi al Nanosight, mentre l’espressione di marcatori esosomiali è stata valutata con l’analisi FACS. Successivamente, le EV sono state somministrate a colture cellulari di sole H9c2 e a co-colture di H9c2 e cellule endoteliali HMEC-1. Dopo l’applicazione di un protocollo di ipossia/riossigenazione, la vitalità cellulare dei cardiomioblasti è stata valutata con il saggio colorimetrico. L’espressione di molecole di segnale intracellulare nelle H9c2 trattate con EV è stata ottenuta mediante Western Blot. Il materiale genetico contenuto nelle EV è stato analizzato utilizzando un array specifico per geni coinvolti nella cardioprotezione. Abbiamo analizzato i dati di 30 pazienti (15 RIPC, 15 SHAM). Le EV isolate da pazienti dei due gruppi erano simili per dimensione, numero e marcatori di superficie. La vitalità delle cellule H9c2 risultava significativamente aumentata nel gruppo RIPC in confronto al gruppo SHAM; al contrario, la vitalità delle H9c2 in co-coltura con HMEC-1 non ha mostrato una differenza statisticamente significativa tra i due gruppi. Le EV RIPC hanno indotto un aumento dei livelli di p-Erk-1/2 e Bcl-2, ma non di p-STAT-3, indicando che la loro azione cardioprotettiva sia probabilmente mediata dall’attivazione della via RISK, e non della via SAFE. L’analisi del contenuto genetico delle EV ha dimostrato un’aumentata espressione di 5 geni, coinvolti nella cardioprotezione, nelle EV del gruppo RIPC. Il nostro studio ha dimostrato che le EV rilasciate dopo RIPC e PCI proteggono i cardiomioblasti dal danno da I/R e ne aumentano la vitalità cellulare, probabilmente incrementando i livelli di p-Erk-1/2 e Bcl-2.| File | Dimensione | Formato | |
|---|---|---|---|
|
TESI ANNA .pdf
non disponibili
Dimensione
907.69 kB
Formato
Adobe PDF
|
907.69 kB | Adobe PDF |
I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/846