La stimolazione mediante PEMF può migliorare il fenotipo tendineo: studio sperimentale in vitro su coltura di espianti tendinei

Hamstring tendons represent one of the most common autologous grafts used during ACL reconstruction. The harvest of the tendon and the time of tendon processing on the operating table, together with the pretensioning manoeuvres and the permanence out of the joint during the time of surgery, might impair tendon derived cells viability. Indeed, hamstring tendons should not be considered simple scaffolds but alive autografts rich in cells showing tenogenic behaviour even after the time and the procedures before joint implantation. The autografts, once inserted, go through a process named ligamentization. It is a histological and biological remodelling of the tendon in order to adopt similar features to healthy ACL. The aim of this study is to show: i) if prolonged exposure to PEMFs may trigger and enhance early tenogenic differentiation; ii) if tendon cells may maintain tendon behaviour under PEMFs exposure. Remnants of semitendinosus and gracilis tendons were collected at the end of the surgical procedures before skin closure from 9 healthy donors who underwent ACL reconstruction with autologous hamstring tendons at San Luigi Gonzaga Hospital in Turin. Samples were plated and cultured in chamber slides in differentiation medium composed of DMEM, 10%fetal calf serum (FCS), 50 µ/ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin ,2 mM L-glutamine and 5 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF-2). Samples were set up into two groups. The study group was cultured and exposed to PEMFs 8h/day for 21 days. The control group was only cultured for 21 days. We used IGEA generator system set at 1.5 mT of intensity of magnetic field and 75 Hz of frequency. Samples were processed and analysed at 21st day. Immunofluorescence analyses were performed to evaluate expression of collagen type I, collagen type VI, scleraxis, mTOR and c-Fos (tenogenic transcription factors), PCNA and beta-catenin (proliferative markers). Tendon cells from the tendon fragments from both groups were alive and they expressed markers of proliferation and tendon phenotype at the end of the culture periods. Expression of scleraxis, collagen type I, collagen type VI and mTOR was significantly increased in study group compared to control group. PCNA expression did not show remarkable difference (p>0,05) between the two groups. The expression of c-Fos was not significantly higher (p>0,05) than control group. The expression of beta-catenin was not significantly lower (p>0,05) than control group. Hamstring tendons used for ACL reconstruction are not simple autologous tenoconductive scaffold but are biological structures rich in progenitor cells that show tenogenic behaviour due to influence of the micro-environment. Exposure to PEMFs can enhance early expression of transcription factors that, helped by tendon micro-environment, commit cells to a tenogenic pathway. Future clinical studies are required to investigate in vivo tendon reaction to PEMFs while it’s in his natural environment. In a future clinical perspective, the postoperative use of PEMF could be used to enhance the ligamentization processes of autologous hamstring tendons, when used as autografts for ACL reconstructions, and to improve tendon repair in rotator cuff surgery and Achilles tendon injury.

I tendini dei muscoli gracile e semitendinoso rappresentano una fonte largamente utilizzata di innesti autologhi per la ricostruzione del legamento crociato anteriore. La raccolta, la loro manipolazione ed il pretensionamento, insieme al tempo trascorso al di fuori dell’articolazione in aria ambiente, potrebbero influire negativamente sulla vitalità delle cellule tendinee. Gli innesti, infatti, sono delle strutture vitali ricche di cellule che mostrano un comportamento tendineo. Essi, una volta impiantati, vanno incontro ad un processo che prende il nome di ligamentizzazione, ovvero un rimodellamento istologico e biologico del neo-legamento al fine di assumere delle caratteristiche più simili al LCA sano. L’obiettivo dello studio è di dimostrare l'efficacia dell’esposizione prolungata ai PEMF nel promuovere il differenziamento precoce tendineo e nel mantenimento della tenogenicità delle cellule dell’innesto attraverso la valutazione dell'espressione di fattori tenogenici. Le estremità libere scartate dei tendini semitendinoso e gracile sono state raccolte a termine dell’intervento da 9 donatori sani sottoposti alla procedura di ricostruzione del legamento crociato anteriore. I campioni tendinei sono stati sezionati e posti in un mezzo di coltura con DMEM, 10% siero fetale di bovino, 50 µg/ml penicillina, 50 mg/ml streptomicina, 2mM L-glutamina e 5ng/ml di FGF-2. I campioni sono stati divisi in due gruppi. Il gruppo studio è stato sottoposto all’esposizione ai PEMF per 8 ore giornaliere per 21 giorni. Il gruppo controllo non ha subito stimolazione ma è rimasto in coltura per lo stesso lasso di tempo. Come sistema generatore di PEMF è stato utilizzato IGEA, modulato con un’intensità di campo magnetico di 1.5 mT e una frequenza di 75 Hz. I campioni sono stati elaborarti ed analizzati a 21 giorni. L’analisi è avvenuta mediante immunofluorescenza al fine di valutare l’espressione di collagene I, collagene VI, scleraxis, mTOR e c-Fos, PCNA e β-catenina. In entrambi i gruppi le cellule tendinee hanno mostrato vitalità, espressione di markers di proliferazione e di fenotipo tendineo alla fine dei 21 giorni. L’espressione di scleraxis, collagene I, collagene VI e mTOR è risultata aumentata rispetto al gruppo di controllo in maniera statisticamente significativa. L’espressione di PCNA non ha mostrato differenze statisticamente significative tra i due gruppi. L’espressione di c-Fos ha rivelato una tendenza all’incremento non statisticamente significativa. L’espressione di β-catenina ha mostrato una tendenza al decremento non statisticamente significativa. Gli “hamstring tendons” sono delle strutture ricche di cellule progenitrici e tendinee vitali, immerse in un microambiente che le influenza verso l’espressione del fenotipo tendineo. L’esposizione ai PEMF può accelerare in fase precoce l’espressione di fattori di trascrizione che, in ambito di microambiente tendineo, indirizzano le cellule verso un “pathway” di differenziamento tenogenico. Sono necessari studi futuri clinici per confermare, in vivo, la risposta alla stimolazione dei PEMF nell’ambiente naturale in cui si trova il tessuto. In una prospettiva clinica futura, l’applicazione post-operatoria dei PEMF potrebbe essere utile a velocizzare e migliorare la ligamentizzazione dell’innesto tendineo autologo di hamstring, quando utilizzato per la ricostruzione del LCA, e i processi di riparazione tendinea dell’entesi nella cuffia dei rotatori e delle lesioni del tendine di Achille.