Determinazione di sostanze di interesse tossicologico su Dried Blood Spots tramite UHPLC-QTOF-HRMS.

L’analisi Dried Blood Spots (DBS) è una tecnica di micro-campionamento basata sulla raccolta di gocce di sangue intero su di un supporto cartaceo. I DBS offrono numerosi vantaggi tra cui: semplicità di campionamento, velocità di trasporto e stoccaggio e maggiore stabilità degli analiti target a temperatura ambiente. Lo scopo di questa tesi risiede nel tentativo di dimostrare la validità di questa tecnica e di evidenziarne le potenzialità nell’ambito della tossicologia forense ed in particolare nell’ormai sempre più noto panorama delle Nuove Sostanze Psicoattive (NSP). Il progetto combina il campionamento DBS con la cromatografia liquida ad altissima prestazione (UHPLC) accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione a tempo di volo (QTOF-HRMS). Il metodo dimostra la possibilità di fare un'analisi simultanea qualitativa e semi-quantitativa di 132 analiti (54 cannabinoidi sintetici, 47 catinoni-allucinogeni sintetici e 31 oppioidi sintetici), utilizzando una procedura di estrazione semplice e rapida. I risultati ottenuti dalla validazione consentono di affermare la validità della procedura; con la possibilità di raggiungere LOD tra 1,3 ng/mL e 6,3 ng/mL. La valutazione dell’accuratezza e precisione inter e intra-day ha dato risultati soddisfacenti per quasi la totalità delle NSP (bias < ± 20%, CV% < ± 20%). Il metodo ha mostrato un recupero compreso tra il 40 ed il 55%; tuttavia, la ripetibilità di estrazione (CV%) è inferiore al ± 20% per quasi tutti i composti. L’effetto matrice è compreso per i cannabinoidi sintetici tra -51% e -33%; per i catitoni e allucinogeni tra -38% e -27% e per gli oppioidi sintetici tra -42% e -30%. Data però, la presenza di molti analiti all'interno della singola goccia, si è pensato che l'effetto matrice fosse dovuto anche alla loro compresenza. Per questo motivo, si è ulteriormente misurato l'effetto matrice per quei composti il cui valore di soppressione ionica superava il 50%. Dai risultati ottenuti si è potuto concludere che l'effetto matrice è fortemente influenzato dalla presenza di molti analiti; fortunatamente questo non accade nei campioni reali. È stata studiata, inoltre, la stabilità in diverse condizioni di temperatura e tempo di conservazione. I dati ottenuti dimostrano che la condizione più conveniente sembra essere a 4°C: a questa temperatura, si osserva una degradazione estremamente limitata degli analiti target addizionati nel sangue e si raggiunge un buon livello di conservazione fino a 40 giorni. Infine, sono stati condotti esperimenti su campioni reali utilizzando campioni di sangue intero venoso precedentemente analizzati nella routine di laboratorio e positivi per fentanil, ketamina o entrambi. I dati sono coerenti con quelli misurati con la procedura di routine. I buoni risultati ottenuti aprono la strada a diverse applicazioni tra cui lo sviluppo preclinico di farmaci, l'analisi diagnostica dei disordini metabolici nei neonati, i test antidroga sul posto di lavoro, il monitoraggio dei farmaci in contesti clinici e forensi, utilizzo di biomarcatori per misurare l’abuso alcolico. Per questa ultima applicazione si è iniziato a sviluppare un metodo DBS per il fosfatidiletanolo (PEth 16:0/18:1), per il quale seguirà la validazione. In futuro, bisognerà anche testare la procedura su veri campioni di sangue intero capillare al fine di dimostrare tutti i vantaggi associati al metodo, così come valutare in modo approfondito l'effetto dell’ematocrito (HT) e la sua influenz