Development of Taqman Real Time PCR method for detection of UGT1A1 polymorphisms

The UGT1A1 gene encodes for UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1, an enzyme responsible for conjugation reactions that allow the inactivation and elimination of endogenous molecules and xenobiotics. Mutations in this gene can have pathogenic effects, causing Gilbert’s syndrome and pharmacogenomics alterations. The genetic basis is a variation in the number of TA repeats in the TATA box of the UGT1A1 promoter, leading to a reduction in the gene expression correlated to the increased number of repetitions. Gilbert’s syndrome causes neonatal hyperbilirubinemia which is mostly a benign condition. These mutations, instead, have also been linked to the administration of Irinotecan, a chemotherapy drug used to treat a variety of cancers. Patients with mutations in UGT1A1 have higher risk of adverse events such as neutropenia and diarrhoea, for this reason the Food and Drug Administration recommended UGT1A1 genotyping before treatment. Sequencing is the gold standard for UGT1A1 genotyping but is not cost efficient and is time consuming. More advantageous techniques can be developed to assess the mutational status of UGT1A1 with more powerful and efficient tools. We tested some protocols from literature based on TaqMan Real Time PCR but, as their results were not satisfactory in identifying the mutant genotypes, we developed an assay using a Real Time PCR duplex probes that can successfully genotype UGT1A1, obtaining results concordant to the sequencing ones.

Il gene UGT1A1 codifica per l'UDP glucuronosiltransferasi famiglia 1 membro A1, un enzima responsabile delle reazioni di coniugazione che consentono l'inattivazione e l'eliminazione di molecole endogene e xenobiotici. Le mutazioni in questo gene possono avere effetti patogeni, causando la sindrome di Gilbert e alterazioni farmacogenomiche. La base genetica è una variazione del numero di ripetizioni di TA nella TATA box del promotore di UGT1A1, che porta a una riduzione dell'espressione genica correlata all'aumento del numero di ripetizioni. La sindrome di Gilbert causa iperbilirubinemia neonatale, che è per lo più una condizione benigna. Queste mutazioni sono state collegate anche alla somministrazione di Irinotecan, un farmaco chemioterapico utilizzato nel trattamento di doversi tumori. I pazienti con mutazioni in UGT1A1 hanno un rischio maggiore di eventi avversi come neutropenia e diarrea, per questo motivo la Food and Drug Administration ha raccomandato la genotipizzazione di UGT1A1 prima del trattamento. Il sequenziamento è il gold standard per la genotipizzazione di UGT1A1, ma non è efficiente in termini di costi e richiede molto tempo. È possibile sviluppare tecniche più vantaggiose per valutare lo stato mutazionale con strumenti più potenti ed efficienti. Abbiamo testato alcuni protocolli presenti in letteratura basati sulla Real Time PCR TaqMan ma, poiché i loro risultati non erano soddisfacenti nell'identificazione dei genotipi mutanti, abbiamo sviluppato un test che utilizza Real Time PCR con sonda duplex in grado di genotipizzare con successo UGT1A1, ottenendo risultati concordanti con quelli ottenuti tramite sequenziamento.