Analisi e confronto degli allergeni presenti nell’insetto e nelle farine di Acheta domesticus con metodo nanoHPLC-HRMS dopo estrazione proteica e SDS-PAGE

Molti insetti edibili costituiscono una fonte alternativa di cibo che può favorire una maggiore sostenibilità della dieta umana e del pianeta. Gli insetti nel ventunesimo secolo assumono un ruolo significativo a causa dell’aumento del costo delle proteine animali, della crescita demografica e dell’alto rischio di una drastica riduzione di risorse per sfamare l’intera popolazione mondiale. Per la FAO gli insetti rappresentano una risorsa altamente nutriente e salutare. Tra gli insetti annoverati nei cosiddetti “Novel Food”, che quindi possono contribuire al miglioramento del sistema alimentare, rientrano i grilli appartenenti alla specie Acheta domesticus. Il grillo ha la peculiarità di essere costituito da una percentuale di proteine pari al 70% del suo peso, soddisfa i requisiti di amminoacidi essenziali (EAA) del fabbisogno umano e animale, è altamente digeribile ed è fonte di micronutrienti e vitamine. Come la maggior parte degli alimenti ad alto contenuto proteico, gli artropodi possono suscitare, quando ingeriti o inalati, reazioni allergiche. La legislazione che regolamenta la produzione dei Novel Foods, così come i nuovi metodi di lavorazione che permettono di commercializzare l’animale in diverse forme, richiede quindi una ricerca approfondita per l’identificazione e la caratterizzazione di nuovi allergeni. Lo scopo principale di questo lavoro di tesi è quello di confrontare le proteine note come allergeni tropomiosina (TM) nelle isoforme 1 e 2 e apolipoforina-III (APO-III) presenti in differenti matrici di grillo Acheta domesticus: farina raffinata, farina grezza e insetto intero. Per poter analizzare matrici così complesse sono state utilizzate due metodiche differenti quali: estrazione delle proteine totali e purificazione e separazione mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Gli estratti totali e le bande del gel (corrispondenti a determinati pesi molecolari), ottenuti dalle due metodiche, sono stati separatamente sottoposti a digestione triptica e analizzati con una metodica nanoHPLC-HRMS (High Performance High Resolution Mass Spectrometry) acquisendo gli spettri di massa in full mass (R=60K) e in DDA (Data Dependent Analysis, R=50k). Gli spettri di massa tandem acquisiti in modalità di attivazione HCD (High Energy Collision Dissociation) sono stati processati utilizzando, come strumento bioinformatico, il Protein Prospector (University of California, San Francisco). Questo ha permesso l’identificazione degli analiti nelle tre matrici e, a seguito della selezione dei peptidi marker per ogni allergene (BLAST, Basic Local Alignment Search Tool), una quantificazione relativa delle proteine nelle diverse matrici analizzate. Lo studio delle matrici dopo estrazione dimostra che l’insetto intero ha un pattern proteico più abbondante con alcune proteine assenti nelle altre due matrici. La tecnica elettroforetica ha mostrato la miglior separazione nel grillo intero probabilmente per l’assenza di agglomerati proteici che invece si formano nelle farine non permettendo la separazione delle proteine. Il presente elaborato, in conclusione, vuole mettere in evidenza alcune differenze che possono presentarsi tra il materiale di partenza e il prodotto finale causate, probabilmente, dai metodi di lavorazione dell’alimento. Queste procedure, infatti, possono migliorare la sicurezza microbica ma, al tempo stesso, modificare il valore nutritivo del prodotto alterandone il contenuto proteico e le proprietà