Background . Human liver stem cells (HLSCs) were described for the first time in 2006 as a new multipotent stem cell population derived from healthy human livers. HLSCs showed self renewing capability, high expansion rate and multilineage differentiation potential. Previous studies have shown that human liver stem cells (HLSCs) may undergo differentiation in vitro in to hepatocyte like cells. The aim of the present study is to better characterise HLSC s in vitro differentiation into hepatocyte like cells using 3D Rotary Cell Culture System (RCCS) Methods HLSCs were isolated and expanded under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions and differentiated in a 3D Rotary Cell Culture System (RCCS) vessel in the presence of differentiation media. After differentiation, specific liver markers were investigated. Results In basal conditions, HLSCs expressed several hepatocyte specific markers such as, albumin, alpha fetoprotein ( αFP), Hepatocyte Nuclear Factor (HNF4) and low level of cytokeratin CK8. After 1 and 4 days of differentiation in RCCS, HLSC aggregates increased the expression of albumin, HNF4 and CK8 and downregulated the expression of αFP. Moreover, differentiated HLSCs increased the expression of three cytochrome P450 isoenzymes and five urea cycle enzymes. The ammonium detoxification activity was also confirmed by the release of urea into the supernatant, after 1 day of differentiation Conclusion In conclusion, HLSCs cultured in the 3D Rotary Cell Culture System differentiated into hepatocyte like cells. Using different experimental approaches to characterize this in vitro assay will be useful for developing an in vitro test to qualify HLSCs as good manufacturing practice (GMP) drug products.
Premessa. Le cellule staminali epatiche umane (HLSCs) sono state descritte per la prima volta nel 2006 come una nuova popolazione di cellule staminali multipotenti derivate da fegato sano. Le HLSCs hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento, alto tasso di espansione e potenziale di differenziamento in diversi tipi cellulari. Studi precedenti hanno dimostrato che le HLSCs possono essere differenziate in vitro in cellule simili agli epatociti. Lo scopo del presente studio è quello di caratterizzare nel dettaglio il differenziamento in vitro delle HLSCs in cellule epatiche utilizzando il metodo 3D Rotary Cell Culture System (RCCS). Metodi. Le HLSCs sono state isolate ed espanse in condizioni di buone pratiche di produzione (GMP) e differenziate mediante un sistema di coltura 3D rotante (RCCS) in presenza di un terreno di differenziamento. Dopo il differenziamento, sono stati studiati i marcatori specifici epatici. Risultati. In condizioni basali, le HLSCs esprimevano diversi marcatori specifici epatici come l’albumina, l’alpha-fetoproteina (αFP) L’Hepatocyte Nuclear Factor (HNF4) e bassi livelli della citocheratina CK8. Dopo 1 e 4 giorni di differenziamento in RCCS, gli aggregati HLSC aumentavano l’espressione dell’albumina, HNF4 e CK8 e riducevano l’espressione dell’αFP. Inoltre, le cellule differenziate in simil-epatociti mostravano un aumento dell’espressione di tre isoenzimi del citocromo P450 e dei cinque enzimi del ciclo dell’urea. L’attività di detossificazione dell’ammonio è stata confermata anche dal rilascio di urea nel surnatante dopo 1 giorno di differenziamento. Conclusione. In conclusione, le HLSCs, coltivate in un sistema 3D rotante di coltura cellulare, possono differenziare in cellule mature simili agli epatociti. L’utilizzo di diversi approcci sperimentali per caratterizzare questo “assay” potranno essere utili per lo sviluppo di un test in vitro per qualificare le HLSCs come prodotti farmaceutici GMP.
3-D in vitro differentiation of human liver stem cells into hepatocyte-like cells
RUSSO, SOFIA
2022/2023
Abstract
Premessa. Le cellule staminali epatiche umane (HLSCs) sono state descritte per la prima volta nel 2006 come una nuova popolazione di cellule staminali multipotenti derivate da fegato sano. Le HLSCs hanno mostrato capacità di auto-rinnovamento, alto tasso di espansione e potenziale di differenziamento in diversi tipi cellulari. Studi precedenti hanno dimostrato che le HLSCs possono essere differenziate in vitro in cellule simili agli epatociti. Lo scopo del presente studio è quello di caratterizzare nel dettaglio il differenziamento in vitro delle HLSCs in cellule epatiche utilizzando il metodo 3D Rotary Cell Culture System (RCCS). Metodi. Le HLSCs sono state isolate ed espanse in condizioni di buone pratiche di produzione (GMP) e differenziate mediante un sistema di coltura 3D rotante (RCCS) in presenza di un terreno di differenziamento. Dopo il differenziamento, sono stati studiati i marcatori specifici epatici. Risultati. In condizioni basali, le HLSCs esprimevano diversi marcatori specifici epatici come l’albumina, l’alpha-fetoproteina (αFP) L’Hepatocyte Nuclear Factor (HNF4) e bassi livelli della citocheratina CK8. Dopo 1 e 4 giorni di differenziamento in RCCS, gli aggregati HLSC aumentavano l’espressione dell’albumina, HNF4 e CK8 e riducevano l’espressione dell’αFP. Inoltre, le cellule differenziate in simil-epatociti mostravano un aumento dell’espressione di tre isoenzimi del citocromo P450 e dei cinque enzimi del ciclo dell’urea. L’attività di detossificazione dell’ammonio è stata confermata anche dal rilascio di urea nel surnatante dopo 1 giorno di differenziamento. Conclusione. In conclusione, le HLSCs, coltivate in un sistema 3D rotante di coltura cellulare, possono differenziare in cellule mature simili agli epatociti. L’utilizzo di diversi approcci sperimentali per caratterizzare questo “assay” potranno essere utili per lo sviluppo di un test in vitro per qualificare le HLSCs come prodotti farmaceutici GMP.| File | Dimensione | Formato | |
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