Alterazioni della funzionalità delle sinapsi GABAergiche dipendenti dai recettori rianodinici durante l’insorgenza della malattia dell’Alzheimer

The accumulation of amyloid proteins, particularly Abeta42, is one of the hallmarks of Alzheimer’s disease (AD). This protein accumulates into the brain following the proteolytic cleavage of the Amyloid Precursor Protein (APP). Many have considered the atypical accumulation of these peptides to be the central triggering event of Alzheimer's disease (AD) onset with consequences on synaptic function and memory loss. The synapse is the election site for neuronal communication and therefore plays a key role in learning processes. Its alteration could be one of the factors behind the Alzheimer’s cognitive impairment, hence this pathology is often defined “synaptic disease”. A common feature of neurodegenerative diseases is represented by the alteration of neuronal calcium signals. This second messenger regulates physiological systems at multiple levels: synaptic plasticity, functioning and survival of neurons with a crucial role in transmission for pre- and postsynaptic mechanisms. The Abeta42 peptide can increase the intracellular calcium concentration at multiple levels: through voltage-dependent calcium channels, NMDA receptors located on the plasmatic membrane or through calcium release from IP3 and ryanodine receptors (RyR). These latter are located on the membrane of endoplasmic reticulum in proximity of synaptic sites and are involved in the control of synaptic activity. This thesis focuses on synaptic alterations dependent by calcium dyshomeostasis phenomena and RyRs impairments. Previous studies have shown that increases of calcium released from RyRs alter excitatory glutamatergic (AMPA, NMDA) synapses at the hippocampal level, whereas no data are available about GABAergic synapses. Therefore, attention has been paid on the role of RyRs at GABAergic synapses, which are responsible for synaptic inhibition through activation of GABAA and GABAB receptors. This inhibition contrasts the effect of glutamatergic synapses; in fact, at a physiological level it is important to maintain the balance between excitatory and inhibitory synapses. It has been frequently observed that it can however be impaired during neurodegenerative diseases. In this work the technique of patch-clamp has been exploited, observing that the peptide Abeta42 induces an increase of GABAergic currents amplitude and a subsequent increase of the number of vesicles immediately ready for release (Readily Releasable Pool, RRP). Furthermore, the use of the molecule S107, known for its ability to bind a ryanodine receptor accessory protein named calstabin, and to stabilize RyRs in a closed conformation, was investigated. It was observed that S107 reduces the amplitude of GABAergic currents and the RRP, bringing both to values comparable to those measured in control. To sum up we have demonstrated that Abeta42 impairs GABAergic synapses and that S107 may play an important role in the treatment of Alzheimer's disease by stabilizing ryanodine receptors and improving hippocampal GABAergic synaptic function.

L’accumulo di proteine amiloidi, e in particolare di Abeta42, è una delle principali caratteristiche della malattia dell’Alzheimer. Questa proteina deriva dal taglio proteolitico della proteina precursore APP (Amyloid Precursor Protein). L’accumulo atipico di questi peptidi è considerato da molti l’evento centrale e scatenante della malattia, con conseguenze sulla funzionalità sinaptica e sulla perdita della memoria. La sinapsi è il sito di elezione per la comunicazione neuronale e svolge pertanto un ruolo fondamentale nei processi di apprendimento. L’alterazione funzionale delle sinapsi può essere infatti il fattore alla base del declino cognitivo legato alla malattia dell’Alzheimer, a tal punto da arrivare a definire questa patologia come “malattia sinaptica”. Un elemento che accomuna le malattie neurodegenerative è rappresentato dall’alterazione dei segnali di calcio neuronali. Questo secondo messaggero ha un ruolo primario nel controllo della plasticità sinaptica, funzionamento e sopravvivenza cellulare. Nella patologia dell’Alzheimer si osserva una disomeostasi del calcio rappresentata da aumenti dei valori di concentrazione intracellulari di tale ione correlabili con le disfunzioni sinaptiche. Il peptide Abeta42 può aumentare la concentrazione intracellulare di calcio a più livelli: attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti, i recettori NMDA situati sulla membrana plasmatica, o tramite il rilascio di calcio dai recettori IP3 e recettori rianodinici (RyR) localizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico. I RyR si trovano principalmente nella porzione di membrana del reticolo endoplasmatico prossima ai contatti sinaptici e sono coinvolti nel controllo dell’attività sinaptica stessa. In questo lavoro di tesi sono state studiate le alterazioni sinaptiche dovute ai fenomeni della disomeostasi del calcio dipendenti dall’alterata funzionalità dei RyR. Studi precedenti hanno dimostrato che, a livello ippocampale, aumenti del rilascio di calcio dai RyR alterano le sinapsi eccitatorie glutammatergiche (AMPA, NMDA), mentre non sono noti in letteratura dati relativi alle sinapsi GABAergiche. Per questo motivo, è stata rivolta l’attenzione al ruolo dei RyR nel controllo della funzionalità delle sinapsi GABAergiche, responsabili dell'inibizione sinaptica attraverso l'attivazione dei recettori GABAA e GABAB. Questa inibizione si contrappone con l’effetto eccitatorio delle sinapsi glutammatergiche e genera un equilibrio che risulta alterato nelle malattie neurodegenerative. Dal punto di vista sperimentale è stata utilizzata la tecnica del patch-clamp e si è osservato che il peptide Abeta42 determina un aumento delle ampiezze delle correnti GABAergiche e un conseguente aumento del numero di vescicole sinaptiche immediatamente pronte per il rilascio (Readily Releasable Pool, RRP). Si è successivamente valutato l’effetto della molecola S107, nota per la sua capacità di legare la calstabina, una proteina accessoria dei RyR. È stato osservato che S107, stabilizzando i RyR in una conformazione chiusa, riduce l’ampiezza delle correnti GABAergiche e l’RRP, portando entrambi a valori paragonabili a quelli misurati in controllo. In conclusione, i risultati ottenuti hanno dimostrato che il peptide Abeta42 altera la funzionalità delle sinapsi GABAergiche e che S107 può svolgere un ruolo importante nel trattamento della malattia dell’Alzheimer stabilizzando i recettori rianodinici e ripristinando una corretta funzionalità sinaptica.