Sviluppo di un metodo biomolecolare per l’identificazione di Anisakis spp.

Anisakis spp., nematode appartenente alla famiglia Anisakidae, è un endoparassita che infesta un numero considerevole di ospiti definitivi e intermedi/parateinici. A causa del suo potenziale zoonosico e della diffusione pressoché globale, il parassita è, ormai da più di 50 anni, di interesse ispettivo. Con il termine anisakiasi si intende la zoonosi parassitaria sostenuta dagli stadi larvali dei nematodi appartenenti al genere Anisakis, contratta dall’uomo a seguito dell’assunzione di prodotti della pesca infestati, consumati crudi o non sufficientemente cotti. La globalizzazione e l’aumento dell’import-export di prodotti ittici hanno contribuito alla diffusione della patologia nell’uomo. Essendo fondamentale l’identificazione delle specie patogene (A. simplex s.s. e A. pegreffii) e non essendo i caratteri morfologici sufficienti per un’identificazione specie-specifica, negli ultimi anni numerose ricerche si sono focalizzate sullo sviluppo di metodiche biomolecolari a supporto della diagnosi morfologica. Le tecniche di maggior successo sviluppate per l’identificazione specie-specifica di Anisakis spp. sono la PCR-RFLP e la multiplex PCR, grazie alle quali è stato possibile differenziare il genere Anisakis da altri affini (e.g. Pseudoterranova spp.) e riconoscere all’interno di questo genere 9 specie. A tale scopo, il presente studio si propone di sviluppare un metodo molecolare per l’identificazione specie-specifica di Anisakis spp., caratterizzato da facile esecuzione ed alti livelli di specificità. Il metodo si basa sulla tecnica del minisequenziamento e utilizza come target le sequenze del gene mitocondriale citocromo-ossidasi subunità II (coxII). In particolare, il test sviluppato si basa sull’analisi di 4 siti di diagnosi conservati in tutte le specie di Anisakis ed è stato validato su 28 campioni. Non è stato possibile applicarlo su tutte le specie, ma è stata validata la specificità dei profili mediante allineamento di 91 sequenze disponibili in Genbank. Il test ha permesso l’identificazione univoca e simultanea dei siti di diagnosi scelti, consentendo la corretta identificazione delle 4 specie di Anisakis spp. (A. simplex s.s., A. pegreffii, A. typica e A. physeteris) su cui è stata applicata, con un elevato potenziale di applicazione a specie delle quali non si aveva DNA disponibile al momento dello studio. La metodica si è dimostrata precisa e affidabile tanto quanto il sequenziamento, con il vantaggio ulteriore di consentire un’interpretazione dei risultati immediata e oggettiva. In conclusione, la tecnica del minisequenziamento proposta rappresenta una valida e affidabile alternativa alla PCR-RFLP e alla multiplex PCR, le uniche procedure finora accreditate dal C.Re.N.A., per l’identificazione delle specie patogene all’interno del genere Anisakis a supporto dell’identificazione morfologica. La metodica racchiude il potenziale per diventare un metodo di grande utilità per i laboratori che lavorano a tutela della salute pubblica e nell’ambito della sicurezza alimentare.