Ottimizzazione di un metodo per la separazione di linfociti di cane da piccole quantità di sangue periferico finalizzata alla determinazione di profili citochinici

It has been shown that, in the case of leishmaniasis the evolution of the disease is closely related to the type of immune response of the organism. In this context, in subjects resistant to infection, a Th1 profile (activation of cell-mediated immunity, characterized by production of IFN-γ) prevails, while a Th2 profile (activation of humoral immunity with production of IL-4) is indicative sensitive subjects. The determination of the Th1 / Th2 balance is generally carried out using methods (RT-PCR, ELISA) that are difficult to convert into clinical practice for the evaluation of individual subjects. In order to evaluate the possible introduction of the Th1 / Th2 profile evaluation in leishmaniotic dogs in a clinical setting, we optimized a method of separation of lymphocytes from peripheral dog blood starting with the limited quantities available for haematological analyzes. An immunomagnetic technique was used, MACS method (Miltenyi), which is based on the use of a magnetic field for the separation of a large number of cells based on specific cell surface markers. The cells are first labeled with monoclonal antibodies and biotinylated magnetic microparticles (microspheres) and are then separated by high gradient magnetic columns. Unlabeled cells pass through the column, while labeled cells are retained. The method was tested by enrichment of CD3 + cells (T lymphocytes) and for depletion of CD11b + myeloid elements. We also evaluated different variables such as the amount of blood, erythrocyte lysis, the amount of antibody, the use of anti-immunoglobulin and anti-fluorochrome magnetic microbeads (used in conjugation with the antibody for detection on the flow cytometer). The optimized protocol includes blood lysis, the labeling with anti-CD11b monoclonal antibody (depletion) and then with anti-IgG microbeads. This protocol was eventually used to separate lymphocytes from peripheral blood of dogs. Lymphocytes were stimulated with PMA and Ionomycin and treated with Brefeldin A to prevent the release of cytokines. After that, we proceeded with the determination of intracellular IFN-γ and IL-4 by flow cytometric analysis, with a positive result. The developed method therefore allows the separation of lymphocytes from peripheral dog blood starting with samples typically taken for routine hematological analysis. These lymphocytes are vital and usable for other cultures. In particular, it is possible to use the method for the determination of intracytoplasmic cytokines in samples for routine clinical-diagnostic analysis with possible utility for diagnostic, prognostic or therapeutic purposes.

È dimostrato che, in corso di leishmaniosi, l’evoluzione della patologia è in stretta relazione con il tipo di risposta immunitaria da parte dell’organismo. In questo quadro nei soggetti resistenti all’infezione prevale un profilo di tipo Th1 (attivazione dell’immunità cellulo-mediata, caratterizzata da produzione di IFN-γ) mentre un profilo Th2 (attivazione dell’immunità umorale con produzione di IL-4) caratterizza i soggetti sensibili. La determinazione dell’equilibrio Th1/Th2 viene effettuata generalmente tramite metodiche (RT-PCR, ELISA) difficilmente trasferibili nella pratica clinica per la valutazione di singoli soggetti. Al fine di valutare la possibile introduzione della valutazione del profilo Th1/Th2 in cani leishmaniotici in un contesto clinico, abbiamo ottimizzato un metodo di separazione dei linfociti da sangue periferico di cane partendo dalle quantità limitate tipicamente disponibili per le analisi ematologiche. È stata utilizzata una tecnica immunomagnetica, metodo MACS (Miltenyi), che si basa sull’uso di un campo magnetico per la separazione di un gran numero di cellule in base a specifici marcatori di superficie cellulare. Le cellule vengono prima marcate con anticorpi monoclonali e con microparticelle (microsfere) magnetiche biotinilate e vengono poi separate su colonne magnetiche ad alto gradiente. Le cellule non marcate passano attraverso la colonna, mentre le cellule marcate vengono trattenute. Il metodo è stato testato per arricchimento di cellule CD3+ (linfociti T) e per deplezione di elementi mieloidi CD11b+. Abbiamo inoltre valutato differenti variabili quali la quantità di sangue, la lisi degli eritrociti, la quantità di anticorpo, l’utilizzo di microsfere magnetiche anti-immunoglobulina e antifluorocromo (utilizzato in coniugazione all’anticorpo per la rilevazione al citofluorimetro). Il protocollo ottimizzato prevede la lisi del sangue, la marcatura con anticorpo monoclonale anti CD11b (deplezione) e poi con microsfere anti-IgG. Questo protocollo è stato infine impiegato per separare linfociti da sangue periferico di cani. I linfociti sono stati stimolati con PMA e Ionomicina e trattati con Brefeldina A per impedire il rilascio delle citochine. Si è quindi proceduto con la determinazione di IFN-γ e IL-4 intracellulari tramite analisi citofluorimetrica, con esito positivo. Il metodo messo a punto consente quindi la separazione di linfociti da sangue periferico di cane a partire dai campioni abitualmente prelevati per l’analisi ematologiche di routine. Tali linfociti risultano vitali e utilizzabili per eventuali colture. In particolare, risulta possibile impiegare il metodo per la determinazione di citochine intracitoplasmatiche su campioni per analisi clinico-diagnostiche di routine con possibile utilità a scopo diagnostico, prognostico o terapeutico.