Nanomedicine is one of the most promising areas of medicine. One of the main application is the preparation of nanoparticles as they allow better pharmacokinetics and biodistribution of the therapeutic and/or diagnostic agents, overcoming some of traditional drug limitations. Despite numerous studies in this field, commercialised formulations are decidedly inferior to traditional drugs due to the lack of knowledge of the interaction processes between nanoparticles and living organisms, as well as difficulties in developing reproducible and standardised synthesis processes. Moreover, there are no indications from national and international regulatory bodies that establish protocols or guidelines for their characterisation. One of the key parameters for nanomedicines is the size of the nanoparticles. In fact, it is known to modulate the biodistribution, and the cellular internalization thus affecting both efficacy and toxicity. This study aimed at the determination of a dimensional range including particles having the same bioactivity for one class of carbon nanoparticles synthesized by a hydrothermal route. This synthetic process meets the basic requirements of green chemistry. Carbon nanoparticles could have a potential use in medicine due to their defined size,antioxidant, photothermal and photodynamic properties. In addition, their marked antioxidant activity in macrophages has been demonstrated, suggesting a potential application for diseases where improper activation of macrophages is undesirable, such as cardiovascular or chronic inflammatory diseases. Carbon nanoparticles having hydrodynamic diameters below and above 100 nm were synthesised . The chemical and physical characterisation was carried out to determine their size, zeta potential, reactivity and surface composition using Dynamic light scattering (DLS), Electrophoretic Light Scattering (ELS) techniques, Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) and Thermogravimetric analysis TGA respectively. The synthesis was found to be reproducible and suitable for a future industrial scale-up. The cytotoxicity towards A-549 human lung adenocarcinoma was assessed. The results showed a rather wide size tolerance range for this type of nanoparticle, down to sub-micrometer sizes. Both carbon nanoparticles did not exert a cytotoxic action towards cells up to 160 µg/mL after 24 h of exposure and no dose-dependent toxicity was detected. To assess the effect of size on the cellular internalisation ,the functionalization of the particles with a linker conjugated to a fluorescent probe (FITC) was attempted. Albeit the linkage was successful, no fluorescence was detected, likely due to a quenching phenomena. The development of a reproducible synthesis of particles of defined sizes lays the foundation for future studies, aimed at assessing the effect on different cellular model of size on not only cytotoxicity, but also internalisation or pro-inflammatory cell activation.
La nanomedicina è uno dei settori più promettenti della medicina.Una delle sue principali applicazioni è la formulazione di nanoparticelle,che consentono un migliore profilo farmacocinetico e una migliore biodistribuzione dell’agente terapeutico e/o diagnostico,superando alcuni limiti dei farmaci tradizionali.Nonostante i numerosi studi,le formulazioni basate su nanovettori che entrano in clinica sono decisamente inferiori rispetto ai farmaci tradizionali.Uno dei motivi è la scarsa conoscenza dei processi di interazione tra nanoparticelle e organismi viventi,unito alle difficoltà nello sviluppare processi di sintesi riproducibili e standardizzati.Inoltre, non vi sono indicazioni degli enti regolatori nazionali e internazionali che stabiliscono dei protocolli o linee guida per la loro caratterizzazione.Uno dei parametri chiave delle nanoformulazioni sono le dimensioni delle particelle.Esse infatti modulano la biodistribuzione e la capacità delle nanoparticelle di entrare all’interno delle cellule,influenzandone quindi sia l’efficacia che la tossicità. Questo lavoro di tesi è stato finalizzato alla determinazione di un intervallo dimensionale che includesse particelle a identica bioattività, per una classe di nanoparticelle di carbonio sintetizzate per via idrotermale. Questo processo sintetico rispetta i requisiti fondamentali della green chemistry.Le nanoparticelle di carbonio potrebbero avere un potenziale utilizzo in medicina grazie alle loro dimensioni definite e alle proprietà antiossidanti, fototermiche e fotodinamiche. Inoltre,è stata evidenziata una loro marcata attività antiossidante nei macrofagi suggerendo potenziale applicazione per le malattie dove l’attivazione impropria dei macrofagi risulta indesiderabile come malattie cardiovascolari o infiammatorie croniche.Sono state sintetizzate nanoparticelle di carbonio aventi diametro idrodinamico inferiore o superiore a 100nm, in quantità nell’ordine dei grammi.Per ogni lotto sono state determinatele dimensioni,il potenziale zeta, la reattività e la composizione superficiale attraverso l’uso rispettivamente delle tecniche Dynamic light scattering (DLS) ed Electrophoretic Light Scattering (ELS), la spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e l’analisi termogravimetrica TGA. La sintesi è risultata riproducibile e adatta scale up industriale.E’ stata quindi valutata la citotossicità dei due lotti verso cellule di adenocarcinoma polmonare umano A-549.I risultati hanno evidenziato un intervallo di tolleranza dimensionale piuttosto ampio per questo tipo di nanoparticelle, fino a dimensioni sub micrometriche.Infatti,entrambe le nanoparticelle di carbonio non hanno esercitato alcuna citotossica fino a una dose di 160µg/mL in seguito a 24h di esposizione.Al fine di poter analizzare l’effetto delle dimensioni sull’internalizzazione cellulare attraverso la citometria,è stata tentata la funzionalizzazione con un linker coniugato ad una sonda fluorescente(FITC).Nonostante l’approccio sintetico abbia portato alla effettiva coniugazione con la sonda,non è stato possibile ottenere delle particelle fluorescenti probabilmente a causa di fenomeni di quenching da parte delle nanoparticelle di carbonio.La messa a punto di una sintesi riproducibile di particelle di dimensioni definite pone le fondamenta per studi futuri, volti all’analisi su diversi modelli cellulari non solo della citotossicità, ma anche del grado di internalizzazione, dell’attivazione cellulare proinfiammatoria.
Definizione di un limite di tolleranza dimensionale per lo sviluppo pre-clinico di nanoparticelle di carbonio per la terapia fototermica dei tumori
PASIO, LUCREZIA
2020/2021
Abstract
La nanomedicina è uno dei settori più promettenti della medicina.Una delle sue principali applicazioni è la formulazione di nanoparticelle,che consentono un migliore profilo farmacocinetico e una migliore biodistribuzione dell’agente terapeutico e/o diagnostico,superando alcuni limiti dei farmaci tradizionali.Nonostante i numerosi studi,le formulazioni basate su nanovettori che entrano in clinica sono decisamente inferiori rispetto ai farmaci tradizionali.Uno dei motivi è la scarsa conoscenza dei processi di interazione tra nanoparticelle e organismi viventi,unito alle difficoltà nello sviluppare processi di sintesi riproducibili e standardizzati.Inoltre, non vi sono indicazioni degli enti regolatori nazionali e internazionali che stabiliscono dei protocolli o linee guida per la loro caratterizzazione.Uno dei parametri chiave delle nanoformulazioni sono le dimensioni delle particelle.Esse infatti modulano la biodistribuzione e la capacità delle nanoparticelle di entrare all’interno delle cellule,influenzandone quindi sia l’efficacia che la tossicità. Questo lavoro di tesi è stato finalizzato alla determinazione di un intervallo dimensionale che includesse particelle a identica bioattività, per una classe di nanoparticelle di carbonio sintetizzate per via idrotermale. Questo processo sintetico rispetta i requisiti fondamentali della green chemistry.Le nanoparticelle di carbonio potrebbero avere un potenziale utilizzo in medicina grazie alle loro dimensioni definite e alle proprietà antiossidanti, fototermiche e fotodinamiche. Inoltre,è stata evidenziata una loro marcata attività antiossidante nei macrofagi suggerendo potenziale applicazione per le malattie dove l’attivazione impropria dei macrofagi risulta indesiderabile come malattie cardiovascolari o infiammatorie croniche.Sono state sintetizzate nanoparticelle di carbonio aventi diametro idrodinamico inferiore o superiore a 100nm, in quantità nell’ordine dei grammi.Per ogni lotto sono state determinatele dimensioni,il potenziale zeta, la reattività e la composizione superficiale attraverso l’uso rispettivamente delle tecniche Dynamic light scattering (DLS) ed Electrophoretic Light Scattering (ELS), la spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e l’analisi termogravimetrica TGA. La sintesi è risultata riproducibile e adatta scale up industriale.E’ stata quindi valutata la citotossicità dei due lotti verso cellule di adenocarcinoma polmonare umano A-549.I risultati hanno evidenziato un intervallo di tolleranza dimensionale piuttosto ampio per questo tipo di nanoparticelle, fino a dimensioni sub micrometriche.Infatti,entrambe le nanoparticelle di carbonio non hanno esercitato alcuna citotossica fino a una dose di 160µg/mL in seguito a 24h di esposizione.Al fine di poter analizzare l’effetto delle dimensioni sull’internalizzazione cellulare attraverso la citometria,è stata tentata la funzionalizzazione con un linker coniugato ad una sonda fluorescente(FITC).Nonostante l’approccio sintetico abbia portato alla effettiva coniugazione con la sonda,non è stato possibile ottenere delle particelle fluorescenti probabilmente a causa di fenomeni di quenching da parte delle nanoparticelle di carbonio.La messa a punto di una sintesi riproducibile di particelle di dimensioni definite pone le fondamenta per studi futuri, volti all’analisi su diversi modelli cellulari non solo della citotossicità, ma anche del grado di internalizzazione, dell’attivazione cellulare proinfiammatoria.| File | Dimensione | Formato | |
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