Boosting protocatechuic acid production in P. putida with a DNA scaffold system

Modern biotechnology aims to improve metabolic processes to optimize the production of chemical compounds by adopting innovative strategies such as metabolic channeling. This phenomenon, observed in natural metabolic pathways, involves enzymes organizing into multi-enzyme complexes called "metabolons," which enhance catalytic efficiency. This study focuses on using metabolic channeling to optimize the conversion of vanillin to protocatechuic acid (PCA) in Pseudomonas putida KT2440. PCA is a lignin-derived monomer with pharmacological properties, produced by P. putida through various metabolic pathways. The study leverages the ferulic acid degradation pathway, an aromatic compound derived from lignin, which produces vanillin as an intermediate in the PCA synthesis. To improve the kinetics of vanillin conversion into PCA, a multi-enzyme system based on DNA scaffolds and fusion proteins with zinc-finger (ZF) domains was developed. These proteins can be engineered to anchor enzymes and substrates in close proximity, promoting metabolite flow and optimizing the enzymatic process. The work was carried out in several phases: first, a PCA-specific biosensor based on Green Fluorescent Protein (GFP) was developed for use as a detection tool in P. putida. Then, a multi-enzyme expression vector and a DNA scaffold library were created, heterologously expressed in P. putida to test various combinations. Among the strains evaluated, strain PC1 showed a reduced lag phase during growth on vanillin, proving to be the most promising for PCA production. The metabolic channeling strategy accelerated the metabolic process in PC1, optimizing the conversion of vanillin. However, the PCA biosensor did not function as expected for high-throughput screening due to a narrow dynamic range, limiting its utility. This indicates that further improvements are needed to make the biosensor a reliable tool. In conclusion, the study highlights how the integration of DNA scaffolds and ZF proteins can enhance metabolic efficiency through the spatial organization of enzymes, offering new opportunities for biotechnological applications. However, challenges remain, such as optimizing the PCA biosensor.

Le biotecnologie moderne mirano a migliorare i processi metabolici per ottimizzare la produzione di composti chimici, adottando strategie innovative come il channeling metabolico. Questo fenomeno, osservato in pathway metabolici naturali, prevede che gli enzimi si organizzino in complessi multienzimatici chiamati "metaboloni", migliorando l'efficienza catalitica. Il presente studio si focalizza sull'uso del channeling metabolico per ottimizzare la conversione della vanillina in acido protocatecuico (PCA) in Pseudomonas putida KT2440. Il PCA è un monomero derivato dalla lignina, con proprietà farmacologiche, prodotto da P. putida attraverso diverse vie metaboliche. Lo studio sfrutta la via di degradazione dell'acido ferulico, un composto aromatico derivato dalla lignina, che produce vanillina, intermedio nella sintesi del PCA. Per migliorare la cinetica della conversione della vanillina in PCA, è stato sviluppato un sistema multi-enzimatico basato su scaffold di DNA e proteine di fusione con domini zinc-fingers (ZF). Queste proteine possono essere progettate per ancorare enzimi e substrati in vicinanza reciproca, favorendo il flusso dei metaboliti e ottimizzando il processo enzimatico. Il lavoro si è articolato in diverse fasi: innanzitutto, è stato sviluppato un biosensore specifico per il PCA, basato sulla Green Fluorescent Protein (GFP), da utilizzare come strumento di rilevamento in P. putida. Successivamente, è stato creato un vettore di espressione multi-enzimatico e una libreria di scaffold di DNA, espressa eterologamente in P. putida per testare diverse combinazioni. Tra i ceppi valutati, il ceppo PC1 ha mostrato una fase di latenza ridotta durante la crescita su vanillina, rivelandosi il più promettente per la produzione di PCA. La strategia del channeling metabolico ha accelerato il processo metabolico in PC1, ottimizzando la conversione della vanillina. Tuttavia, il biosensore per il PCA non ha funzionato come previsto per lo screening ad alto rendimento a causa di un intervallo dinamico ristretto, limitando la sua utilità. Questo implica che sono necessari ulteriori miglioramenti per rendere il biosensore uno strumento affidabile. In conclusione, lo studio evidenzia come l'integrazione di scaffold di DNA e proteine ZF possa migliorare l'efficienza metabolica attraverso l'organizzazione spaziale degli enzimi, offrendo nuove opportunità per applicazioni biotecnologiche. Tuttavia, restano sfide da affrontare, come l'ottimizzazione del biosensore per il PCA.