Caratterizzazione di poliplessi a base di polimeri 𝛽-ciclodestrinici per la veicolazione di acidi nucleici

Gene therapy is a pharmacological approach which has gained relevance in the last decade for its versatility and efficacy, especially for cancer disease. However, its progress is limited by the difficulties in the production of efficient, safe, and easily manufactured delivery systems. Among non-viral vectors, the β-cyclodextrin-based cationic polymers are attracting widespread interest for their low toxicity and capability to form self-assembling polyplexes with nucleic acids by simple electrostatic attraction. The aim of this study was the characterization of a library of cationic, linear, and hydrophilic polymers with a structure based on β-cyclodextrin, choline and carbonyldiimidazole at 1:9:8 molar ratio (βCDI) and functionalized with increasing lipophilicity alkylic groups (methyl, pentyl, and decyl). All the polymers were capable to complex plasmidic DNA at sequential N/P ratios (from 1 to 20) as showed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) on agarose gel. Moreover, the ability to complex siRNA at N/P=20 was shown and the relative polyplexes dimensions were measured by DLS analysis resulting in a range between 100 and 400 nm, while the surface charge was confirmed as positive for all the polymers. Their stability and complexing ability were confirmed up to 7 days (at physiological pH and 4°C storage) and in presence of heparin by EMSA. Between the evaluated polymers, βCDI methylated was the most interesting for its stability at physiological pH combined with the ability to increase its size at acid pH that could enable an efficient intracellularly release of gene material. Furthermore, the native βCDI was used to prepare a ternary complex with siRNA and chitosan (N/P=10) to obtain polyplexes with superior pharmacologic proprieties that showed zeta potential and dimensions coherent with the previous formulations. Additionally, cytotoxicity and hemolytic activity assays carried on non-complexed polymers have indicated that these cyclodextrin compounds are excellent candidates for future clinical use. The polyplexes obtained represent an interesting class of non-viral vectors for the delivery of nucleic acids with therapeutic potential thanks to their high biocompatibility. These systems may be further developed in future studies.

La terapia genica è un trattamento farmacologico che si è consolidato negli ultimi anni grazie alla sua versatilità ed efficacia, soprattutto in ambiti patologici di difficile trattamento come la terapia antitumorale. Il suo progresso è però limitato dalle difficoltà di fabbricazione di sistemi di delivery degli acidi nucleici che siano sicuri, efficienti e di facile preparazione. Tra i vettori non virali, particolarmente interessanti sono i polimeri cationici a base di β-ciclodestrine per la loro bassa tossicità e la capacità di formare poliplessi auto assemblanti con gli acidi nucleici tramite sola attrazione elettrostatica. In questa tesi, è stata caratterizzata una libreria di polimeri cationici lineari e idrofili, derivati da una struttura base di β-ciclodestrine, colina e carbonildiimidazolo in rapporto molare di 1:9:8 (βCDI) e funzionalizzati con gruppi alchilici a lipofilia crescente (sostituenti metilici, pentilici, decilici). Tutti i polimeri hanno mostrato di essere in grado di complessare il DNA plasmidico a rapporti di N/P sequenziali (da 1 a 20), come dimostrato tramite elettroforesi su gel di agarosio. È stata determinata, inoltre, la capacità di complessazione con siRNA a N/P=20, portando alla formazione di poliplessi con ridotto diametro idrodinamico misurato tramite DLS, compreso tra i 100 ed i 400 nm e carica superficiale positiva. La stabilità e la capacità complessante di tali poliplessi è stata confermata fino a 7 giorni in condizioni di conservazione (4°C) e pH fisiologico, nonché in presenza di eparina, tramite elettroforesi. Tra i polimeri valutati βCDI metilato si è mostrato particolarmente promettente per la sua stabilità a pH fisiologico unita alla capacità di aumentare le sue dimensioni a pH acido che potrebbe abilitarlo ad un efficiente rilascio di materiale genico in sede intracellulare. Parallelamente βCDI è stato usato per formare complessi ternari con siRNA e chitosano (N/P = 10), in modo da ottenere poliplessi con proprietà farmacologiche superiori, i quali hanno mostrato potenziale zeta e dimensioni coerenti con le altre formulazioni. Inoltre, la conduzione di saggi di citotossicità e di attività emolitica sui polimeri non complessati hanno indicato questi composti ciclodestrinici come degli ottimi candidati per un futuro uso clinico. I poliplessi da essi ottenuti rappresentano una interessante classe di vettori non virali per la veicolazione di acidi nucleici con potenziale terapeutico grazie all’elevata biocompatibilità. Questi sistemi potranno essere ulteriormente sviluppati nei prossimi studi