Analisi del profilo genomico di pazienti pediatrici affetti da Osteosarcoma

Background. Osteosarcoma (OS) is the third most frequent bone tumour in paediatric age. 5-years overall survival was 50% after the introduction of adjuvant and neoadjuvant chemotherapy: nowadays, after the introduction of multimodal treatment, the strengthening of chemotherapy and the improved patient risk stratifications, we reached 65% 5-os. Nevertheless we still ignore OS carcinogenesis process and we know very little about any potential biomolecular therapeutic targets. Aim of the study. The study, included within the framework of SARGEN and SARGEN-ITA projects, is designed to characterize the genomic and clinical profile of a cohort of paediatric OS patients, with the aim of investigating any significant mutations or genetic abnormalities in carcinogenesis process and, eventually, identifying any therapeutical targets. Materials and Methods. Bioptical tumor fresh samples and blood samples in EDTA from 11 patients were sequenced. Each sample underwent to WES analysis to identify somatic mutations according to the following criteria: single base mutations and small insertions/deletions identified by at least two independent software (VarScan2, Mutect and Strelka), mutations supported by at least 10 mutated sequences, with allelic frequency >/ 5% and 1% of readings mapped to both DNA strands. Additional selection criteria are: classification of the mutation as a known cancer gene sarcoma, CADD score > 10. Results.9 out of 11 patients have more than a thousand variants within the genome; 3 exceed 2000 variants and 1 has 3134 variants. Of these, at least 50 variants per patient are non-silent; 97% are SNP and the most frequent mutational type is non-synonymous. The most frequent substitution is C>A transversion, followed by C>T transition. The rate of similarity between patient pairs is very low, stopping at 1%. The median TMB for selected mutations is 7*10-7 mutations per Mb. The selected mutations among all variants are 566, with an average of 51 selected mutations per patient. CADD score analysis revealed a median of 26 damaging mutations per patient. The selected genes that are mutated in multiple patients are: MUC4 (3/11 patients), NBPF4 (3/11 patients), NBPF8 (3/11 patients), NTRK3 (3/11 patients). The most affected molecular pathways are RTK-RAS (5/11 patients), NOTCH (5/11 patients) and HIPPO (3/11 patients). Discussion and Conclusions. Clinical and genetic profile analysis of OS patients has confirmed some data in medical literature, but leaves some questions open for the near future. OS is a tumour with a low mutational rate, characterized by high intra- and inter-tumour heterogeneity. Although the difference in biological significance between transitions and transversions is mostly unknown, the abundant presence of C>T transitions in selected genes suggests a contribution of epigenetic phenomena in oncogenesis processes. Although RB1, TP53 and REQL4 alone explain part of the OS formation process, it is evident that this is not sufficient to explain the totality of the cases; our study highlights how some biomolecular pathways such as RTK-RAS and NOTCH or some genes such as MUC4, APC and NTRK may play a crucial role in etiopathogenesis and, in future, as a therapeutical targets. Despite the low power of the study due to the small sample size (11 patients), this could be used as a benchmark to validate future genomic analyses with a larger pool of patients.

Background. L’Osteosarcoma (OS) è il tumore osseo più frequente dell’età pediatrica. Con l’introduzione della chemioterapia pre e post operatoria negli anni Settanta, la sopravvivenza a 5 anni è salita al 50%. Oggi, nonostante i significativi miglioramenti ottenuti tramite la stratificazione dei pazienti, il rafforzamento dell’approccio chemioterapico e l’introduzione del trattamento multimodale (sopravvivenza a 5 anni - 65%), la nostra conoscenza del processo di carcinogenesi resta limitata, così come l’approccio terapeutico basato sulla medicina di precisione. Obiettivo dello studio. Lo studio intende caratterizzare il profilo genomico e clinico di una coorte di pazienti pediatrici affetti da OS, con il fine di identificare eventuali mutazioni o anomalie genetiche significative nel processo di cancerogenesi e/o utilizzabili come bersagli terapeutici Materiali e Metodi. Sono stati sequenziati i campioni bioptici tumorali a fresco di 11 pazienti affetti da OS e il corrispondente campione ematico. Ogni campione è stato sottoposto ad analisi WES per identificare le mutazioni somatiche secondo i seguenti criteri: mutazioni a singola base e piccole inserzioni/delezioni identificate tramite due software indipendenti (VarScan2, Mutect e Strelka), mutazioni supportate da almeno 10 sequenze mutate, con frequenza allelica >/ 5% e l’1% di letture mappate su entrambi i filamenti di DNA. Criteri di selezione aggiuntivi sono: appartenenza della mutazione ad un sarcoma cancer gene noto, CADD score > 10. Risultati. 9 pazienti su 11 presentano più di mille varianti all’interno del genoma; 3 superano le 2000 varianti e 1 presenta 3134 varianti. Di queste almeno 50 varianti per paziente sono non silenti; il 97% sono SNP e il tipo mutazionale più frequente è la non sinonima. La sostituzione più frequente è la transversione C>A, seguita dalla transizione C>T. Il tasso di similarità fra coppie di pazienti è molto basso, fermandosi all’1%. Il TMB mediano per le mutazioni selezionate è 7*10-6 mutazioni per Mb. Le mutazioni selezionate fra tutte le varianti sono 566, con una media di 51 mutazioni selezionate per paziente. L’analisi tramite CADD score ha rivelato una mediana di 26 mutazioni danneggianti per paziente. I geni selezionati che risultano mutati in più pazienti sono: MUC4 (3/11 pazienti), NBPF4 (3/11 pazienti), NBPF8 (3/11 pazienti), NTRK3 (3/11 pazienti). I pathway molecolari più colpiti sono RTK-RAS (5/11 pazienti), NOTCH (5/11 pazienti) e HIPPO (3/11 pazienti). Discussione e Conclusioni. L’analisi del profilo clinico e genetico del campione di pazienti affetti da OS ha confermato alcuni dati presenti in letteratura, ma lascia in sospeso alcuni interrogativi per il prossimo futuro. L’OS è un tumore dal basso tasso mutazionale, caratterizzato da alta eterogeneità sia intra sia inter-tumorale. Nonostante la differenza di significato biologico fra transizioni e transversioni sia perlopiù ignota, l’abbondante presenza di transizioni C>T nei geni selezionati suggerisce un contributo dei fenomeni epigenetici nei processi di oncogenesi. Sebbene RB1, TP53 e REQL4 spieghino da soli parte del processo di formazione dell’OS, è evidente come questo non sia sufficiente a spiegare la totalità dei casi; il nostro studio mette in luce alcuni pathway biomolecolari come RTK-RAS e NOTCH o alcuni geni come MUC4, APC e NTRK, che potrebbero giocare un ruolo cruciale sia dal punto di vista eziopatogenetico sia terapeutico nel prossimo futuro. Nonostante la bassa potenza dello studio dovuto all’esigua numerosità campionaria (11 pazienti), questo potrebbe essere utilizzato come benchmark al fine di validare future analisi genomiche con un pool maggiore di pazienti.