Exploring an AAV-intein based platform as a potential therapeutic strategy for EYS-associated retinal disorders

Inherited retinal diseases (IRDs) are a group of debilitating conditions caused by mutations that compromise retinal function and lead to vision loss. While gene therapy offers promise for IRDs, the limited cargo capacity of adeno-associated viral (AAV) vectors prevents the effective delivery of large genes. This poses a significant challenge for treating IRDs caused by genes exceeding the AAV packaging limit, such as EYS – a gene crucial for retinal health, whose mutations are associated with retinitis pigmentosa. To address this limitation, we have recently developed an AAV-based strategy relying on the use of short protein elements called inteins. These, when fused at the extremities of fragments of a large protein delivered to cells through AAV, can mediate joining of the fragments in a traceless manner, resulting in the reconstitution of the intact target protein, at levels which we proved to be therapeutically relevant. Building on our previous success with this approach we sought to exploit the AAV-intein approach for reconstitution of the EYS protein. We identified functional intein insertion sites within EYS and selected orthogonal split-inteins to minimize cross-reactivity and ensure directional fragment joining. In vitro experiments demonstrated that our AAV-EYS-intein vectors expressed the fragments effectively, undergoing protein trans-splicing with variable efficiency. Our results offer preliminary support for the potential of AAV-inteins to deliver the large EYS gene, providing a promising new strategy to address gene therapy challenges associated with treatment of this form of retinitis pigmentosa.

Le malattie retiniche ereditarie (IRD) sono un gruppo di condizioni debilitanti causate da mutazioni che compromettono la funzione retinica e portano alla perdita della vista. Sebbene la terapia genica offra speranza per le IRD, la limitata capacità di carico dei vettori virali associati ad adenovirus (AAV) impedisce la trasduzione efficace di geni di grandi dimensioni. Questo rappresenta una sfida significativa per il trattamento delle IRD causate da geni che superano il limite di capienza dell’AAV, come EYS - un gene fondamentale per la salute retinica, le cui mutazioni sono associate alla retinite pigmentosa. Per affrontare questo limite, abbiamo recentemente sviluppato una strategia basata su AAV che si basa sull’uso di brevi elementi proteici chiamati inteine. Questi, quando fusi alle estremità di frammenti di una grande proteina espressa nelle cellule attraverso l’AAV, possono mediare l’unione dei frammenti in modo non tracciabile, ricostituendo la proteina target intatta, a livelli che abbiamo dimostrato essere terapeuticamente rilevanti. Sulla base del nostro precedente successo con questo approccio, abbiamo cercato di sfruttare l’approccio AAV-intein per la ricostituzione della proteina EYS. Abbiamo identificato siti funzionali di inserimento di intein all’interno di EYS e selezionato split-inteine ortogonali per minimizzare la reattività incrociata e garantire l’unione direzionale dei frammenti. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che i nostri vettori AAV-EYS-intein esprimevano efficacemente i frammenti, subendo trans-splicing proteico con efficienza variabile. I nostri risultati offrono un supporto preliminare per il potenziale degli AAV-inteins nell'espressione di un gene grande come EYS, fornendo una nuova strategia promettente per affrontare le sfide della terapia genica associate al trattamento di questa forma di retinite pigmentosa.