Genome editing of PKD1 using CRISPR/Cas9: creation and characterization of variant alleles to explore ADPKD genotype-phenotype correlation

Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) is the most common single-gene disorder leading to kidney failure. Almost 80% of cases of ADPKD are attributed to germline variants in PKD1, a significant proportion of which is classified as “variant of unknown significance” (VUS). The aim of my thesis has been to develop a cellular model to rapidly determine the functional impact of novel variant of unknown significance. To do so, the HEK293T cell line was transfected with a sgRNA targeting exon 15 of PKD1 to generate homozygous (Ex15-/-) or heterozygous mutants (Ex15+/-). The progression of ADPKD is in line with a “double hit” model, which means that inactivation of both copies of PKD1 by germline and somatic variants is necessary for cyst development. For this reason, PKD1 WT and heterozygous clones were then used to introduce a specific additional variant on exon 42, [c.11614G>A p. (E3872K)] using base editors. Once confirmed that the expression of Polycystin-1 (PC-1) was consistent with the genetics of the generated cellular lines and based on previously published literature, functional assays focused on focal-adhesion formation, apoptosis and autophagic flux were subsequently performed to validate the model and to confirm the pathogenicity of the exon 42 variant. The results suggested that PKD1 nonsense and missense variants introduced in HEK293T could represent a valuable method to investigate genotype-phenotype correlations. To elucidate the mechanisms underlying these correlations, we used the exon 15 genetic model to introduce other variants, specifically in exon 44 [c.12061C>T p.(R4021*)] and exon 46 [c.12682C>T p.(R4228*)] using Target-AID base editor. The introduction of these variants and their functional validation is still on going. In conclusion, the results presented in this thesis represent a proof of principle of the feasibility of the model, which will be used to reproduce additional variants of unknown significance identified in PKD1 gene.

Il rene policistico autosomico dominante (ADPKD) è la più comune forma di malattia ereditaria che porta all'insufficienza renale. Quasi l'80% dei casi di ADPKD è attribuito a varianti germinali nel gene PKD1, una proporzione significativa delle quali è classificata come "variante di significato sconosciuto" (VUS). Lo scopo della mia tesi è stato quello di mettere a punto modelli cellulari sperimentali che consentissero di valutare rapidamente l’impatto funzionale di varianti sconosciute. A tal proposito, la linea cellulare HEK293T è stata trasfettata con un sgRNA targhettante l'esone 15 del PKD1 per generare mutanti omozigoti (Ex15-/-) o eterozigoti (Ex15+/-). La progressione della malattia è in linea con la teoria del “double hit", ossia un modello in cui è necessaria l'inattivazione di entrambe le copie del PKD1, sia da varianti germinali che somatiche, per lo sviluppo delle cisti. Per questo motivo, i cloni WT ed eterozigoti sul PKD1 sono stati utilizzati per introdurre una specifica variante aggiuntiva sull'esone 42 [c.11614G>A p. (E3872K)] utilizzando AncBE4max come cytosine base editor (CBE). Una volta confermato che l'espressione della policistina 1(PC-1) (prodotto genico del PKD1) fosse coerente con la genetica delle linee cellulari generate e basandosi sulla letteratura precedentemente pubblicata, sono stati successivamente eseguiti dei saggi funzionali focalizzati sulla formazione di adesioni focali, l’apoptosi e l’autofagia per convalidare il modello e confermare la patogenicità della variante sull'esone 42. I risultati hanno suggerito che le varianti nonsense e missenso introdotte nel gene PKD1 nella linea cellulare HEK293T potessero rappresentare un valido metodo per investigare le correlazioni genotipo-fenotipo. Sulla base di ciò abbiamo utilizzato il modello genetico sull'esone 15 per introdurre altre varianti, specificamente nell'esone 44 [c.12061C>T p.(R4021*)] e nell'esone 46 [c.12682C>T p.(R4228*)] utilizzando il Target-AID come CBE. Queste varianti sono tuttora in corso di validazione. In conclusione, i risultati presentati in questa tesi rappresentano una prova del principio della fattibilità del modello, il quale potrà essere utilizzato per la riproduzione di ulteriori varianti di significato sconosciuto identificate nel gene PKD1. Questi modelli renderanno anche possibili studi di validazione genotipo-fenotipo.