Cellule tumorali circolanti in pazienti con tumore solido: applicazioni ed impatto clinico

Precision medicine is playing an increasingly important role in clinical practice. In particular, it is a priority to improve the sensitivity and specificity levels of genomic profiling within this minimally invasive biopsy method, often based on the analysis of circulating tumor DNA and cells. The objective of tour work was to study, at a quantitative level, the profiling of circulating tumor cells (CTCs) enriched through Parsortix technology. CTCs are cells that originate from the primary tumor and, by circulating in the peripheral blood, can also give rise to new metastatic sites. When these cells are found in the peripheral blood, they are a more specific marker of the presence of the tumor compared to circulating nucleic acids, which can increase in the blood as a result of natural physiological processes. However, to date, the use of CTCs in patient genomic profiling is limited by the lack of intra- or inter-experimental comparability of these analyses. Therefore, it is crucial to define new metrological concepts and reference measures to integrate this method into the diagnostic technologies that can be used in clinical laboratories. To evaluate the methodology and our ability to identify the limits of mutation detection, we used two commercial kits that recognize two different mutations of codon 12 of the K-RAS oncogene. These kits, named dHsaMDV2510596 and dHsaMDV2510588, detect the mutations leading to the amino acid variations K-RAS and G12D. These were used in combination with digital PCR to lay the groundwork for identifying the minimum amount of mutated material, either genomic or cellular, that we can detect after CTC enrichment with Parsortix. We also observed that the low storage temperature of the blood sample significantly increases the amount of trapped cells and that the enrichment results do not benefit from the depletion of nucleated blood cells after storage. In this study, we demonstrate how circulating tumor cell enrichment techniques, combined with their characterization in cancer patients, can be used for the evaluation of potential minimal residual disease, recurrence, metastasis, or to determine the response to therapy. All of this is made possible by the ability of this approach to detect minimal amounts of tumor material of interest, both at the genomic and cellular level. In conclusion, although the preliminary nature of these results is evident, the insights they provide encourage us to continue in our efforts to achieve the reproducibility and accuracy characteristics that will allow us, in the future, to confidently use the results derived from circulating tumor cell enrichment obtained through liquid biopsy.

La medicina di precisione sta assumendo un ruolo sempre più importante nella pratica clinica. In particolare, risulta prioritario poter migliorare i livelli di sensibilità e specificità della profilazione genomica nell’ambito di questo metodo bioptico, poco invasivo, spesso basato sull’analisi del DNA e delle cellule tumorali circolanti. L’obiettivo del nostro elaborato è stato quello di studiare a livello quantitativo la profilazione di cellule tumorali circolanti (CTC) arricchite mediante la tecnologia Parsortix. Le CTC sono cellule che originano dal tumore primario e, circolando nel sangue periferico, possono dare anche origine a nuovi siti metastatici. Queste cellule, se trovate nel sangue periferico, sono un marcatore più specifico della presenza del tumore rispetto agli acidi nucleici circolanti che possono aumentare nel sangue anche a seguito di naturali processi fisiologici. Ad oggi però l’utilizzo delle CTC nella profilazione genetica del paziente è limitata dalla mancanza di comparabilità intra o inter-sperimentale di queste analisi. Risulta pertanto fondamentale la definizione di nuovi concetti metrologici e di misure di riferimento da utilizzare per integrare questa metodica tra le tecnologie diagnostiche utilizzabili nei laboratori di analisi. Per valutare la metodica e la nostra capacità di identificare i limiti del rilevamento mutazionale abbiamo utilizzato due kit commerciali che riconoscessero due diverse mutazioni nel codone 12 dell’oncogene K-RAS. Questi kit denominati dHsaMDV2510596 e dHsaMDV2510588, riconoscono le mutazioni che portano alle variazioni amminoacidiche K-RAS G12S e G12D. Queste sono state utilizzate in combinazione con la PCR digitale per gettare le basi per identificare la minima quantità di materiale mutato, a livello genomico o cellulare, che siamo in grado di individuare dopo arricchimento di CTC con il Parsortix. Abbiamo inoltre osservato che la bassa temperatura di conservazione del campione di sangue aumenta in maniera significativa la quantità di cellule intrappolate e che i risultati dell’arricchimento non beneficiano della deplezione delle cellule nucleate del sangue dopo conservazione. In questo studio mostriamo come le tecniche di arricchimento di cellule tumorali circolanti, associate alla loro caratterizzazione molecolare tramite droplet digital PCR, possono essere sfruttate in futuro a tutti gli effetti per implementare la caratterizzazione del paziente oncologico, così come per la valutazione di una eventuale malattia minima residua, di una recidiva, di un processo di metastatizzazione o per determinare la risposta alla terapia. Tutto ciò è reso possibile dalla capacità di questo approccio di rilevare quantità minime di materiale tumorale di interesse, inteso sia a livello genomico, che cellulare. In conclusione, sebbene il carattere preliminare di questi risultati sia evidente, le indicazioni che forniscono ci stimolano a proseguire per cercare di ottenere le caratteristiche di riproducibilità/accuratezza che ci permetteranno, in futuro, di utilizzare con fiducia i risultati derivati dall’arricchimento di cellule tumorali circolanti ottenuti mediante biopsia liquida.