Valutazione comparativa qualitativa e quantitativa di differenti tipologie di fissativi istologici e decalcificanti nelle procedure previste per la gestione dei tessuti osteo-midollari nei laboratori di anatomia patologica

Bone marrow biopsies play a fundamental role in the diagnosis of hematological diseases, including staging in cases of infiltrative tumors. They are also useful in providing targeted and personalized patient care, improving prognosis where possible, through specific histological or immunohistochemical examinations using a minimally invasive procedure. For a bone marrow biopsy to be useful in diagnosis and prognosis, it must be processed through a standardized pathway. The most critical point of this pathway is the cutting phase, which occurs after processing and embedding the biopsy; this is due to the very nature of the sample. In fact, the matrix of these samples is mineralized, making it highly resistant even to the sharp blade of a microtome. To avoid this inconvenience, decalcification of the sample is necessary before processing; this step allows the tissue to release calcium salts, which are responsible for bone resistance, in order to facilitate the cutting phase on the microtome as much as possible. Another consequent problem is due to the characteristics of the decalcifying agent itself as it tends to degrade the biopsy's DNA; this is a significant problem because it prevents the patient from having access to a genotyping of the disease and personalized targeted therapy. The objective is to find a valid protocol, applicable to routine hospital practice, that allows not only to decalcify bone marrow biopsies quickly and optimally but also to preserve as much genetic material as possible from these samples for subsequent second-level analyses. To this end, a comparative study was conducted between three fixatives (formaldehyde, GAF, Bouin) and three decalcifying agents (EDTA-based produced by Diapath with basic pH and Milestone with neutral pH, 8% HCl at acidic pH). The results seem to be in line with the scientific literature: Bouin preserves nuclear morphological details but the histochemical (Giemsa) and immunohistochemical preparations are qualitatively poor. Nucleic acids are degraded due to picric acid and therefore not preserved. The remaining two fixatives, Formalin and GAF, are comparable in terms of the morphological and structural quality of histological preparations. Also, in the field of molecular biology, the degree of DNA fragmentation for samples fixed with Formalin or GAF is comparable. Regarding decalcifying agents, decalcification is faster with acidic pH solutions (8% HCl) and slower with basic EDTA-based solutions. However, the degree of DNA fragmentation is almost similar and high. The EDTA- based decalcifying agent at neutral pH (Mol-Dec), on the other hand, if comparable to the other two in terms of morphological quality and reliability of histochemical and immunohistochemical staining, proves to be clearly superior in terms of nucleic acid preservation; however, the use of this decalcifying agent in the routine of anatomical pathology laboratories may not be compatible with their workflow.

Le biopsie osteo-midollari ricoprono un ruolo fondamentale nella diagnosi di malattie di tipo ematologico, inclusa la stadiazione in caso di tumori infiltrativi. Esse sono anche utili per fornire una cura target e personalizzata al paziente, migliorandone in quanto possibile la prognosi, attraverso esami specifici quali istologici o di tipo immunoistochimico attraverso un prelievo non troppo invasivo. La biopsia osteo-midollare, affinché possa essere utile nella diagnosi e nella prognosi, deve essere processata attraverso un percorso standardizzato. Il punto più critico di questo percorso è la fase del taglio, che avviene dopo la processazione e l’inclusione della biopsia; ciò è dovuto alla natura stessa del campione. Infatti, la matrice di questi ultimi è mineralizzata, il che la rende altamente resistente anche alla lama affilata del microtomo. Per evitare questo inconveniente è necessario, prima della processazione, una decalcificazione di tale campione; questo step permette al tessuto di liberare i sali di calcio, i quali sono i responsabili della resistenza ossea, in modo da facilitare il più possibile la fase del taglio al microtomo. Un altro conseguente problema è dovuto alle caratteristiche del decalcificante stesso poiché tende a degradare il DNA della biopsia; questo è un problema non indifferente, perché preclude al paziente la possibilità di avere accesso ad una genotipizzazione della malattia e ad una cura target personalizzata. L’obbiettivo che si vuole raggiungere è quello di trovare un protocollo valido, applicabile alla routine ospedaliera, che permetta non solo di decalcificare le biopsie osteo-midollari in modo veloce ed ottimale, ma anche di preservare quanto più possibile materiale genetico da tali campioni per analisi successive di secondo livello. A tal proposito, è stato effettuato uno studio comparativo tra tre fissativi (formaldeide, GAF, Bouin) e tre decalcificanti (a base di EDTA prodotti da Diapath con pH basico e Milestone con pH neutro, HCl 8% a pH acido). I risultati sembrano essere in linea con la letteratura scientifica: il Bouin preserva dettagli morfologici nucleari ma i preparati istochimici (Giemsa) e immunoistochimici risultano qualitativamente carenti. Gli acidi nucleici sono degradati a causa dell’acido picrico e quindi non preservati. I restanti due fissativi, Formalina e GAF, risultano equiparabili in termini di qualità morfologica e strutturale dei preparati istologici. Anche in ambito della biologia molecolare, il grado di frammentazione del DNA per i campioni fissati con Formalina o GAF è equiparabile. Per quanto riguarda i decalcificanti, la decalcificazione risulta più rapida con soluzioni a pH acido (HCl 8%) e più lenta con soluzioni EDTA- based a pH basico. Il grado di frammentazione del DNA è pressoché simile ed elevato. Il decalcificante EDTA-based a pH neutro (Micro-Dec), invece, se in ambito di qualità morfologica ed affidabilità di colorazioni istochimiche e immunoistochimiche è comparabile agli altri due, si rivela nettamente superiore in termini di preservazione degli acidi nucleici; tuttavia, l’utilizzo di tale decalcificante in routine dei laboratori di anatomia patologica, potrebbe non essere compatibile con il flusso di lavoro degli stessi.