In vitro anti-inflammatory effect of extracellular vesicles derived from human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells cultured under optimized conditions

Background. Human umbilical cord mesenchymal stem cells- derived extracellular vesicles (hUC MSC EVs) have anti-inflammatory properties and offer several advantages over administering intact MSCs, making them a promising therapeutic approach for inflammatory diseases. Serum is commonly added to hUC MSC expansion media to improve cell adhesion and proliferation, but its use is discouraged in new biological medicines due to the risk of animal product transmission. Therefore, we investigated whether hUC MSC EVs cultured in serum-free media retain their anti-inflammatory properties. Methods. hUC MSC were cultured in four different culture media and subsequently, EVs were obtained from hUC MSC maintained in the optimized culture media: αMEM supplemented with 5% platelet lysate (PL) and RoosterNourish. The anti-inflammatory role of EVs was analysed in two different assays: RAW 264.7 cells were treated with minimum essential medium high glucose (DMEM HG) and lipopolysaccharide (LPS) for 6 hours, with or without EVs, or pretreated with LPS 6 hours and then treated until 24h with hUC MSC EVs. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) was performed to assess the expression of inflammatory genes. Results. hUC MSC cultured in αMEM with 5% PL and RoosterNourish have a higher overall growth curve. Additionally, hUC MSC- derived EVs maintain their mesenchymal origin. In the preventive assay, treatment with EVs significantly induced cytokine activation in a dose dependent reduction manner, especially at 2000 and 5000 EVs/cell concentration. In the curative assay, treatment with EVs did not reduce cytokine expression. Conclusion. hUC MSC expansion in αMEM with 5%PL and RoosterNourish preserved the anti-inflammatory properties of EVs, and culturing in serum free medium would improve in vivo therapeutic potential of hUC MSC-derived EVs.

Introduzione. Le vescicole extracellulari (EVs) derivate da cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (hUC MSC) possiedono capacità antinfiammatorie e presentano diversi vantaggi rispetto alla somministrazione delle MSC intatte, rendendole un promettente approccio terapeutico nelle patologie infiammatorie. Il siero viene comunemente aggiunto ai terreni di espansione delle hUC MSC per migliorare l'adesione delle cellule e stimolarne la proliferazione in vitro, ma il suo utilizzo è sconsigliato nella produzione di nuovi farmaci biologici a causa del rischio di trasmissione del prodotto animale. Pertanto, abbiamo indagato se le EVs derivate da hUC MSC, espanse in terreni privi di siero, mantenessero le loro proprietà antinfiammatorie. Metodi. hUC MSC sono state espanse in quattro diversi terreni di coltura e successivamente, le EVs sono state ottenute a partire da hUC MSC espanse in due terreni di coltura ottimizzati: αMEM supplementato con lisato piastrinico e RoosterNourish. Il ruolo antinfiammatorio delle EV in vitro è stato analizzato in due diversi saggi: le cellule RAW 264.7 sono state trattate con DMEM HG LPS per 6 ore, con o senza EVs, o pretrattate con LPS per 6 ore e poi trattate fino alle 24h con hUC MSC EVs. Per valutare l'espressione dei geni infiammatori è stata eseguita la PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR). Risultati. Le hUC MSC mantenute in αMEM+5%PL e RoosterNourish possiedono una curva di crescita complessivamente più elevata. Inoltre, le EVs derivate dalle hUC MSC mantengono la loro origine mesenchimale. Nel saggio preventivo, il trattamento con le EVs induce in modo significativo l’inibizione dose dipendente dell’espressione delle citochine, soprattutto alle concentrazioni di 2000 e 5000 EV/cellula. Nel saggio curativo il trattamento con le EVs non riduce l'espressione delle citochine. Conclusione. L'espansione delle hUC MSC in αMEM+5%PL e RoosterNourish consente di mantenere le capacità antinfiammatorie delle EV e la coltura in un terreno privo di siero migliorerebbe una potenziale terapia con le EVs in vivo nel paziente.