L’identificazione di marcatori di senescenza in colture di astrociti derivati da cellule staminali umane

Senescence is a physiological process of cell renewal, however it can be also induced by various intrinsic and extrinsic stress factors. Given the role that astrocytes play in maintaining brain homeostasis, it seems that the accumulation of dysfunctional and senescent astrocytes is implicated in the etiopathogenesis of several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD) and multiple sclerosis. Although reproducing the senescence phenotype in a controlled in vitro system presents limitations, several research groups created in vitro models of "aged astrocytes" that show an increase in the percentage of senescence in late passages of primary rat and mouse astrocyte cultures and of man. My thesis project aims to investigate the presence or absence of senescence markers in lines of astrocytes obtained from an experimental glial differentiation protocol of induced human pluripotent stem cells (hiPSCs) from healthy subjects which does not involve multiple passages of cells in vitro. It has been shown that these astrocytes have a senescence rate of around 25%, as indicated by SA-β-Galactosidase staining. They also present a low positivity to the markers 53BP1 and γH2AX recruited to the sites of damage with DNA double-strand breaks. In contrast, we found a senescent phenotype in human astrocytes derived from subjects affected by autosomal dominant leukodystrophy (ADLD), a demyelinating disease characterized by duplication of the gene for lamin B1 (5q23.2), resulting in accumulation of the protein. This result confirms the association of lamin B1 with senescence, already suggested by the literature, and represents a first indication of alteration present in ADLD astrocytes.

La senescenza è un processo fisiologico di rinnovamento cellulare, tuttavia può anche essere indotta da vari fattori intrinseci ed estrinseci di stress. Visto il ruolo che gli astrociti ricoprono nel mantenimento dell’omeostasi cerebrale, sembra che l’accumulo di astrociti disfunzionali e senescenti sia implicato nell'eziopatogenesi di diverse malattie neurodegenerative, incluso il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD) e la sclerosi multipla. Sebbene riprodurre il quadro di senescenza in un sistema controllato in vitro presenti delle limitazioni, diversi gruppi di ricerca hanno ideato modelli in vitro di “astrociti invecchiati” che mostrano un incremento della percentuale di senescenza in passaggi tardivi di colture primarie astrocitarie di ratto, di topo e di uomo. Il mio progetto di tesi si prefigge l’obiettivo di investigare sulla presenza o meno di marcatori di senescenza in linee di astrociti ottenuti da un protocollo sperimentale di differenziamento gliale di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) di soggetti sani che non preveda passaggi multipli delle cellule in vitro. Si è dimostrato che tali astrociti presentano una percentuale di senescenza che si aggira intorno al 25%, come indicato dalla colorazione della SA-β-Galattosidasi. Presentano, inoltre, una bassa positività ai marcatori 53BP1 e γH2AX reclutati sui siti di danno con rottura a doppio filamento del DNA. Al contrario, abbiamo riscontrato un fenotipo senescente in astrociti umani derivati da soggetti affetti da Leucodistrofia autosomica dominante (ADLD), una malattia demielinizzante caratterizzata dalla duplicazione del gene per la lamina B1 (5q23.2), con conseguente accumulo della proteina. Questo risultato conferma l’associazione della lamina B1 con la senescenza, già suggerita dalla letteratura, e rappresenta una prima indicazione di alterazione presente negli astrociti ADLD.